СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ИМПЛАНТИРУЕМЫХ ИЗДЕЛИЙ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и биологии, клеточным технологиям, патологической анатомии, фармакологии, токсикологии, и может быть использовано для оценки биосовместимости имплантируемых изделий на этапе их разработки и создания, а также для постмаркетинговой оценки и углубленного изучения зарегистрированных и применяемых имплантируемых изделий медицинского назначения с целью улучшения их биосовместимости. В качестве тестируемых изделий могут быть использованы любые синтетические материалы для имплантации: дентальные имплантаты, эндопротезы для герниопластики, эндопротезы суставов, пластины для нейрохирургии, дренажные системы, стенты, шовный материал.

Оценка биосовместимости изделий медицинского назначения проводится как in vitro, так и in vivo [1, 2]. Тестирование in vitro подразумевает получение той или иной популяции клеток в виде прикрепленных культур - фибробластов, мезенхимально-стромальных клеток или неприкрепленных суспензионных культур и т.д. с последующей оценкой необходимых морфо-функциональных показателей клеток в присутствии тестируемого материала. При таком виде тестирования материала или изделия невозможно получить необходимой и достоверной информации в полном объеме в силу отсутствия всех необходимых взаимодействий между выбранными в качестве тест-системы клетками и другими клетками, отсутствующими в тест-системе, что ограничивает возможности и эффективность такого анализа.

Поэтому любое исследование in vitro с применением клеток требует последующих этапов исследований in vivo, в результате которых возможно получение результата в основном на уровне тканей, что иногда требует длительного периода наблюдения.

В настоящее время ведущая роль в оценке биосовместимости материалов принадлежит макрофагам. В организме функции макрофагов очень разнообразны. Они осуществляют не только фагоцитоз чужеродного материала, клеточно-тканевого детрита, но и стимуляцию и регуляцию иммунного ответа, индукцию воспаления, участвуют в репаративных процессах и обмене компонентов внеклеточного матрикса в физиологических условиях. Именно поэтому разнообразие их функций определяет реакцию тканей при имплантации изделий, т.е. биосовместимость, что может быть использовано для ее оценки.

Известен способ получения резидентных макрофагов путем выращивания их из моноцитов крови в присутствии GM-CSF, после чего возможна оценка морфо-функциональных показателей клеток на тестируемое изделие [3]. Метод очень трудоемкий, недостаточно количество клеток, необходимых для тестирования, а дифференцировка моноцита требует длительной культивации в течение 7-9 дней до начала тестирование материала, результаты которого можно интерпретировать как скрининговые.

Известен способ получения резидентных макрофагов из перитонеального экссудата мыши с целью использования выделенной популяции клеток для оценки биосовместимости материалов. Для этого животных эвтаназируют цервикальной дислокацией. В брюшную полость вводят 3-4 мл изотонического буфера с добавлением 5000 ЕД гепарина и 20 мл сыворотки эмбрионов коров из расчета на 1 л. Перитонеальную жидкость медленно аспирируют шприцем. Собранный перитонеальный экссудат помещают в охлажденные до 0°C силиконизированные центрифужные пробирки. Клетки осаждают, ресуспендируют осадок в растворе Хенкса. До засева культуры клетки сохраняют на льду. С целью увеличения количества клеток иногда используют предварительное введение в брюшную полость животного раздражающих веществ. Через 3-4 суток выполняют эвтаназию мыши и аспирацию ее перитонеального экссудата. Полученные перитонеальные макрофаги культивируют в течение 4 суток в специальных условиях, затем приступают к тестированию материалов [4, 5].

Данный способ взят за прототип.

Недостатком способа является необходимость эвтаназии животного, длительность его реализации в условиях in vitro, недостаточное количество получаемых для тестирования клеток, изменение функциональной активности клеток после введения в брюшную полость животного раздражающих веществ, а в некоторых случаях изменение их морфологических характеристик, исключение возможности взаимодействия макрофагов с другими клетками, оказывающих регуляторную функцию. Способ не во всех случаях позволяет получить достоверные результаты.

Целью изобретения является разработка способа получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости.

Эта цель достигается тем, что животному после анестезии выполняют средне-срединную лапаротомию, в брюшную полость имплантируют тестируемый образец материала, укладывая его на петли тонкой кишки и укрывая большим сальником, рану послойно ушивают; через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) in vitro, снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют ЭТС.

Техническим результатом предлагаемого способа является возможность получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости.

Способ позволяет не только выделить клетки с поверхности образца тестируемого материала, но и оценить изменение их морфо-функциональных характеристик под действием имплантируемого изделия. Полученные результаты являются достоверными, поскольку при его реализации происходят естественные процессы взаимодействия макрофагов с другими клетками в течение 56 часов in vivo, присутствует «среда» сигнальных молекул и регуляторных белков в брюшной полости и нет необходимости в эвтаназии животного.

Способ получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости реализуется следующим образом. На этапе in vivo мелкому грызуну (мыши, крысе) под анестезией (рометар + золетил, в/м) после предварительной обработки операционного поля выполняют средне-срединную лапаротомию с протяженность разреза от 1 см до 4 см. В брюшную полость на петли тонкой кишки помещают стерильный тестируемый материал, укрывают его большим сальником, который является источником тканевых макрофагов. Размеры образца тестируемого материала предварительно подбирают в зависимости от веса животного и объема его брюшной полости. Рану послойно ушивают. Через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с ЭДТА in vitro, снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% ЭТС и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют ЭТС.

Данный способ лишен недостатков известных способов, поскольку прост в реализации, не требует последующей эвтаназии животного. Способ иллюстрируется следующим примером, реализованным на базе ИЭМБ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России.

Эксперименты выполнены на 46-ти белых крысах обоего пола весом 180-250 г, которые в зависимости от вида имплантируемого изделия были разделены на 2 группы. В брюшную полость крыс первой группы в асептических условиях под общим обезболиванием (золетил - 3 мг/кг + рометар - 2 мг/кг, внутримышечно) были установлены фрагменты стандартных (50-70 г/м²) полипропиленовых эндопротезов для герниопластики. Животным второй группы аналогичным образом были установлены титановые эндопротезы. Площадь имплантируемого материала составляла 12-20 см² в зависимости от размера животного и объема его брюшной полости. Через 52 часа в асептических условиях образцы эндопротезов извлекали, обрабатывали 0.25% раствором трипсина "Gibco" c ЭДТА («Invitrogen»), снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывали инкубационной средой и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, а осадок ресуспендировали в ЭТС. Для оценки морфо-функциональных показателей макрофагов из полученной суспензии делали мазки, которые фиксировали абсолютным этиловым спиртом и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Данные мазки позволили определить соотношение тучных клеток, эозинофилов, полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов и макрофагов. Также выполнено иммуноцитохимическое исследование полученных клеток (активность миелопероксидазы), НСТ-тест.

Среди адгезированных на поверхности полипропилена клеток чаще встречали крупные и базофильные формы, а также двух- и трехядерные клетки. В среднем число макрофагов, содержащих более одного ядра, составляло 1.27% на полипропиленовых эндопротезах, 0.67% - на титановых (p<0,01). Митозы обнаружены в трех из пятнадцати (20%) снятых с титановых и в восьми из четырнадцати (57%) снятых с полипропиленовых эндопротезов клеточных популяциях (p<0,05). Выявлены существенные различия между полипропиленовыми и титановыми эндопротезами в отношении активности адгезированных к ним клеток. Доля НСТ-позитивных макрофагов среди мононуклеаров на полипропиленовых образцах значительно выше, чем на титановых. Гранулы продукта реакции видны и в многоядерных клетках, но активность в них по сравнению с одноядерными ниже. На титановых поверхностях они в большинстве случаев НСТ-отрицательны. Все адгезированные к поверхности эндопротезов нейтрофильные лейкоциты и часть макрофагов обладали миелопероксидазной активностью. Продукт реакции часто обнаруживали в митотически делящихся клетках. Относительное количество макрофагов с миелопероксидазной активностью было больше на полипропиленовых образцах, чем на титановых. Полученные результаты позволили установить, что изделия для герниопластики на основе титана обладают лучшей биосовместимостью по сравнению с полипропиленовыми изделиями.

Данный способ может найти широкое применение в экспериментальной медицине.

ИСТОЧНИКИИНФОРМАЦИИ

1. Eddouks M., Chattopadhyay D., Zeggwagh N. Ali. Animal Models as Tools to Investigate Antidiabetic and Anti-Inflammatory Plants. Evid Based Complement Alternat. Med. 2012; 2012: 142087. Published online 2012 July 29. doi: 10.1155/2012/142087.

2. Liao J-C., Deng J-S, Chiu C-S, Hou W-C, Huang S-S, Shie P-H, Huang G-J. Anti-Inflammatory Activities of Cinnamomum cassia Constituents In Vitro and In Vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 429320. Published online 2012. March 27. doi: 10.1155/2012/429320.

3. Anderesen R, Scheibenbogen C, Brugger W, Krause S, Meerpohl HG, Leser HG, Engler H, GW. Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating blood monocytes: a new approach to cancer immunotherapy. Cancer Res. 1990. Dec. 1; 50(23):7450-6.

4. Hogg N, Parish CR. Surface antigens of the murine cytostatic peritoneal macrophage. Immunology. 1980 Sep; 41(1):187-93.

5. Kohn F.R., Kung A.H. Role of endotoxin in acute inflammation induced by gram-negative bacteria: specific inhibition of lipopolysaccharide-mediated responses with an amino-terminal fragment of bactericidal/permeability-increasing protein. Infect Immun. 1995. January; 63(1): 333-339.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и биологии, и может быть использовано для оценки биосовместимости имплантируемых изделий. Для этого получают клетки с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости. Животному после анестезии выполняют средне-срединную лапаротомию, в брюшную полость имплантируют тестируемый образец материала, укладывая его на петли тонкой кишки и укрывая большим сальником, рану послойно ушивают. Через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с этилендиаминтетрауксусной кислотой in vitro. Снимают адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотке и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют эмбриональной телячьей сывороткой. Использование данного способа позволяет получить культуру клеток для комплексной оценки биосовместимости имплантируемых изделий в условиях для взаимодействия макрофагов с тестируемым материалом in vivo и оценить морфо-функциональные показатели клеток после такого взаимодействия в условиях in vitro.

Способ получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости, включающий забор биологического материала из брюшной полости мелких грызунов с последующим его исследованием, отличающийся тем, что животному после анестезии выполняют средне-срединную лапаротомию, в брюшную полость имплантируют тестируемый образец материала, укладывая его на петли тонкой кишки и укрывая большим сальником, рану послойно ушивают; через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с этилендиаминтетрауксусной кислотой in vitro, снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют эмбриональной телячьей сывороткой.