ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ STEVIA REBAUDIANA BERTONI - ПРОДУЦЕНТ СЛАДКИХ ГЛИКОЗИДОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и заключает в себе способ получения методом изолированных культур клеток растений ценного растительного сырья.

Известно, что Stevia rebaudiana Bertoni (медовая трава) - растение семейства Аsteraceae (сложноцветные) - содержит в листьях до 7% дитерпеновых гликозидов, сладость которых в 50-450 раз больше сладости сахарозы, и может быть использовано для получения интенсивного, некалорийного, диетического подсластителя, применяемого в пищевой промышленности.

Stevia rebaudiana Bertoni растет в субтропической зоне, распространена в Гвиане и Парагвае. На территории СССР не произрастает.

Цель изобретения - получение штамма культивируемых клеток Stеvia rebaundiana Bertoni семейства Аsteraceae, обладающего способностью продуцировать сладкие гликозиды.

Исходным материалом для получения каллусной ткани служат листья стерильно растущих растений в возрасте 20-30 дней.

Штамм SR-I депонирован в коллекции культивируемых клеток высших растений в институте физиологии растений АН СССР. Коллекционный номер штамма 43.

Каллусная ткань от светло-желтого и бежевого цвета (активно растущая) до коричневого и черного (старая), ростовой индекс 8,0-9,0 (по сырому весу), количество живых клеток в середине экспоненциальной фазы роста 80-92% .

Каллусная ткань выращивается при комнатной температуре 26 + 1^оС, влажности 50-60% , в темноте на агаризованной питательной среде в течение 23-25 сут под ватно-марлевыми пробками. Состав питательной среды, мг/л: KNO₃ 1890-1900 NH₄NO₃ 1640-1650 MgSO₄ · 7H₂O 360-370 CaCl₂· 2H₂О 430-440 KH₂PO₄ 160-170 MnSO₄· 4H₂O 22,2-22,3 KI 0,82-0,83 H₃BO₃ 6,1-6,2 ZnSO₄· 7H₂O 8,5-8,6 CuSO₄ · 5Н₂O 0,024-0,025 Na₂MoO₄· 2H₂O 0,24-0,25 CoCl₂· 6H₂O 0,024-0,025 FeSO₄· 7H₂O 27,84-27,86 Na₂ЭДТА 37,24-37,26 Мезоинозит 100 Тиамин-НCl 0,4 α -НУК 2,0 Кинетин 1,0 Гидролизат казеина 500
Сахароза 30000
Агар 6500-7500
Н₂O до 1 л
рН 5,8-6,0
Сосуды для выращивания и объем питательной среды в них: банки для расфасовки сметаны объемом 200 мл, содержащие 70-75 мл питательной среды. Кратность рассева 1: 5-6.

Цитологическая характеристика.

Культура состоит преимущественно из клеток округлой и эллипсовидной формы. Размеры фиксированных клеток на давленных препаратах в середине экспоненциальной фазы роста от 23 до 335 мкм, в среднем 73 мкм. Размеры ядер от 0,3 до 17,0 мкм, в среднем 3,8 мкм. Пик митотической активности приходится на 15-е сутки. Митотический индекс 2,2% .

Кариологическая характеристика.

Пределы варьирования по числу хромосом 16-132, модальный класс 24-40. Имеется не менее двух пар маркерных хромосом: хромосомы с микроспутником и хромосомы с двойной перетяжкой. Маркерные признаки: 1. Содержание свободных сахаров в сухой биомассе - фруктозы 2,3-2,5% , глюкозы 1,4-1,6% . 2. Содержание гликозидов 2,0-3,3% на сухое вещество.

Способность к морфогенезу отсутствует.

Штамм культивируемых клеток Stevia rebaudiana Bertoni SR-I N 43 является продуцентом сладких гликозидов. Определение содержания гликозидов проводили с помощью высокоразрешающей жидкостной хроматографии. В воздушно-сухой ткани на 25-е сутки роста суммарное количество гликозидов составило 2,0-3,3% в пересчете на сухое вещество.

Для хранения штамма используют метод пересевов (продолжительность цикла выращивания 23-25 сут).

П р и м е р. Инокулятный материал в количестве 1,2 г высевают в сосуд с 70 мл твердой питательной среды следующего состава, мг/л: NH₄NO₃ 1650 KNO₃ 1900 CaCl₂ · 2H₂O 440 MgSO₄ · 7H₂O 370 KH₂PO₄ б/в 170 H₃BO₃ 6,2 ZnSO₄ · 7H₂O 8,6 MnSO₄ · 4H₂O 22,3 KI 0,83 Na₂ЭДТА 37,25 Na₂MoO₄· 2H₂O 0,25 CuSO₄ · 5H₂O 0,025
CoCl₂ · 6H₂O 0,025
FeSO₄ · 7H₂O 27,85
α -НУК 2,0 Кинетин 1,0 Тиамин-хлорид 0,4 Мезоинозит 100 Гидролизат казеина 500,0 Сахароза 30000,0 Агар 7000,0 Н₂O до 1 л рН 5,9
Выращивают 25 сут при 26 + 1^оС в темноте под ватно-марлевыми пробками при влажности 50-60% . Вес полученной биомассы составляет 12,4 г (177,1 г/л), т. е. прирост составил 11,2 г (160,0 г/л). Ростовой индекс 10,3. Вес воздушно-сухой биомассы 0,8 г (11,4 г/л). Суммарное количество гликозидов 3,0% от воздушно-сухого веса.

Сравнение химического состава биомассы и листьев Stevia rebaudiana проводили методом высокоразрешающей жидкостной хроматографии. Было установлено, что в каллусной ткани Stevia rebaudiana присутствуют три гликозида, аналогичные гликозидам в листьях интактного растения.

Предлагаемый штамм является перспективным для выращивания в промышленных условиях с целью получения интенсивного некалорийного диетического подсластителя для нужд пищевой, фармацевтической и косметической отраслей промышленности.

Использование: биотехнология, фармацевтическая промышленность, медицина, пищевая промышленность. Сущность изобретения: получен штамм культивируемых клеток растения Stevia rebaudiana Bertoni - продуцент сладких гликозидов.

Штамм культивируемых клеток растений Stevia rebaudiana Bertoni ВСКК-ВР N 43 - продуцент сладких гликозидов.