СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения пероксидазы из биомассы культивируемых растительных клеток.

Известен способ получения пероксидазы из листьев полыни [1], включающий гомогенизацию растительный ткани, экстракцию фермента водным раствором, содержащим NaCl в концентрации 0,49-0,51 М и аскарбат натрия в концентрации 0,029-0,031 М, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию.

Недостатком известного способа является невысокая активность пероксидазы.

Целью изобретения является увеличение выхода и активности пероксидазы.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения пероксидазы, включающему гомогенизацию растительной ткани полыни, экстракцию фермента водным раствором NaCl, фракционирование экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацию и ионно-обменную хроматографию, в качестве растительной ткани используют каллусную культуру полыни, а для экстракции фермента используют водный раствор NaCl в концентрации 0,5-2,0 М.

Получение каллусной культуры полыни.

Выращивание культуры клеток осуществлялось на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением гормонов - нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрации 2,0 мг/л и кинетина в концентрации 1 мг/л. В качестве эксплантатов использовались стебли и корни полыни.

Состав среды Мурасиге-Скуга, мг/л: NH₄NO₃ 1650; KNO₃ 1900; CaCl₂ ˙2H₂O 440; MgSO₄ ˙7H₂O 370; KH₂PO₄ 170; CuSO₄˙ 5H₂O 0,025; ZnSO₄ ˙7H₂O 8,6; Na₂MoO₄ ˙2H₂O 0,25; KI 0,83; FeSO₄ ˙7H₂O 27,8; H₃BO₃ 6,2; MnSO₄ ˙4H₂O 22,3; CoCl₂ ˙6H₂O 0,025; Na₂ЭДТА ˙2H₂O 37,3; Тиамин ˙HCl 0,1; Пиридоксин ˙HCl 0,5; Никотиновая кислота 0,5; Мезоинозит 100,0; Глицин 2,0; НУК 2,0; Кинетин 1,0; Сахароза 30000,0.

Питательную среду после внесения всех компонентов стерилизовали автоклавированием в вертикальном автоклаве при давлении 1,0-1,2 атм., при 120^оС в течение 20 мин.

На чертеже представлена ионо-обменная хроматография на КМ-целлюлозе белков из каллусной культуры полыни A. annua.L.

Получение гомогенного ферментного препарата из каллусной культуры полыни.

Выделение фермента проводилось по следующей схеме: гомогенизация в дистиллированной воде, содержащей 1 М NaCl, экстракция 1,5-2,0 ч.

Зависимость активности пероксидазы из каллусной культуры полыни однолетней от концентраций NaCl приведена в табл. 1.

Осадок (отбрасываем)
Центрифугирование 10000 об/мин, 30 мин
надосадочная жидкость
осаждение сульфитом аммония до конечного 80%-ного насыщения, центрифугирование
Надосадочная фракция
(отбрасываем)
Осадок перерастворяется в 0,005 М Трис-HCl буфере рН 7,2, диализ против этого же буфера, центрифугирование
суммарный препарат пероксидазы,
ионно-обменная хроматография на ДЕАЕ-
целлюлозе, элюирование Трис-HCl буфером,
фракция незадерживаемая
на ДЕАЕ-целлюлозе (0 фракция)
ионнообменная хроматография на
КМ-целлюлозе, элюирование проводили
в линейном градиенте молярности
0,005-0,25 М ацетатного буфера рН 4,4
Препарат пероксидазы
гель-фильтрация на Т-50
Гомогенный ферментный препарат
Результаты выделения фермента представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, для очистки щелочной фракции пероксидазы использовали 0 фракцию, т.е. нe задерживаемую на ДЕАЕ-целлюлозе фракцию, наносили на КМ-целлюлозу, смывали связавшиеся сносителем фракции непрерывным градиентом молярности 0,005 и 0,25М ацетатного буфера рН 4,4. Белок выходил 2 пиками (чертеже), а в дальнейшем для работы использовали 2-ой пик, элюируемый при ионной силе 0,14-0,15 М, т.к. он имел максимальную активность и наибольшую степень очистки (RZ = 1,7). C целью получения препарата проводилась дальнейшая очистка гель-фильтрацией на Thoypetl-50, где фермент выходил одним пиком. Если учесть, что фракционное осаждение сульфатом аммония дает 5-6-кратную очистку, то нами была достигнута 140-кратная степень очистки (28 х 5). Гомогенность пероксидазы показана электрофорезом в полиакриламидном геле при рН 4,3 (15% акриламид) и рН 8,3 (7,5% акриламид).

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение фермента пероксидазы с высокой удельной активностью и большим чем в способе-прототипе выходе.

Использование: биотехнология и может быть использовано для получения пероксидазы из биомассы культивируемых растительных клеток. Сущность изобретения: Способ получения пероксидазы включает гомогенизацию каллусной культуры полыни, экстракцию фермента водным 0,5 - 2,0 М раствором NaCl, фракционирование экстракта сульфатом аммония, ионно-обменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и КМ-целлюлозе, гельфильтрацию на сефадексе Toyopearl - 50. 1 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ, предусматривающий гомогенизацию растительной ткани полыни, экстракцию фермента водным раствором поваренной соли, фракционирование сульфатом аммония с последующим проведением гельфильтрации и ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что в качестве растительной ткани используют каллусную культуру полыни, экстракцию фермента проводят 0,5 - 0,2 М раствором поваренной соли, а гельфильтрацию осуществляют после ионообменной хроматографии последовательной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе и КМ-целлюлозе.