СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/68 

Предлагаемый способ определения активности лейцинаминопептидазы (ЛАП) (Л-лейцинпептидгидролазы К.Ф. 3.4.1.1.) относится к медицине, в частности к методам лабораторной диагностики заболеваний. Определение активности этого фермента в клинике наиболее часто проводится при диагностике заболеваний печени, желчных протоков, поджелудочной железы.

Известна методика определения активности ЛАП, в которой в качестве субстрата используется Л-лейцил-n-нитроанилид [1]. Однако эта методика пригодна для определения активности ЛАП лишь в неокрашенных жидкостях. Исследование же, например, дуоденального сока этим методом становится невозможным, т.к. в зоне максимума поглощения n-нитроанилина ( λ = 410 ммк) сок обладает значительной оптической плотностью.

Достаточно простым и универсальным представляется способ определения активности ЛАП по Гольдбаргу и Рутенбергу [2], где субстратом служит Л-лейцил-β-нафтиламид. Мартинек с соавторами [3] упростили метод Гольдбарга и Рутенберга, исключив из процедуры определения осаждение белков и последующее центрифугирование проб. Последняя модификация методики была положена в основу набора реактивов для определения активности ЛАП [4].

Этот способ определения активности ЛАП основан на спектрофотометрическом определении количества β-нафтиламина, освобождающегося при действии фермента на синтетический субстрат Л-лейцил-β-нафтиламид. По окончании необходимого времени инкубации исследуемой биологической жидкости с указанным субстратом ферментативную реакцию останавливают путем добавления к смеси соляной кислоты. Далее, образовавшийся β-нафтиламин диазотируют и затем сочетают с N-(1-нафтил)-этилендиамином дигидрохлоридом. При этом образуется растворимое в воде соединение синего цвета. Интенсивность окрашивания раствора измеряют на спектрофотометре. Оптическая плотность окрашенных растворов пропорциональна концентрации β-нафтиламина, содержание которого, в свою очередь, пропорционально активности ЛАП в исследуемом материале.

Способ определения активности ЛАП известным методом, например, в сыворотке крови включает в себя ряд последовательных этапов.

1. К 0,5 мл исследуемой разведенной сыворотки прибавляют 0,5 мл забуференного раствора субстрата Л-лейцил- β-нафтиламида. Параллельно ставятся "слепые" пробы с субстратом и с сывороткой крови. Пробы инкубируют в течение 1 часа при 37^oC.

2. После инкубации в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2н. HCl для остановки ферментативной реакции и создания кислого pH раствора.

3. В пробирки приливают по 0,5 мл раствора NaNO₂ для диазотирования β-нафтиламина.

4. Выжидают 3 минуты.

5. Далее в пробирки приливают по 1 мл раствора сульфамата аммония для разрушения избытка нитрита натрия.

6. Выжидают 3 минуты.

7. Вносят в пробирки по 2 мл раствора N-(1-нафтил)- этилендиамина, который сочетается с диазотированным β-нафтиламином и образует окрашенное в синий цвет соединение.

8. Через 20 минут растворы фотометрируют при λ = 585 ммк против воды и, пользуясь калибровочным графиком, рассчитывают активность ЛАП.

Недостатком описанной методики является то, что в ней относительно много реактивов и, соответственно, много этапов, связанных с отмериванием рабочих растворов. Значительное неудобство представляет необходимость соблюдения двух строго фиксированных трехминутных интервалов между отдельными процедурами, т. к. из-за этого затруднительно проводить определение активности ЛАП одновременно в нескольких образцах биологического материала.

Способ определения активности ЛАП по Гольдбаргу-Рутенбергу [2] в модификации Мартинека с соавт. [3] рассматривается нами в качестве прототипа.

Целью предлагаемого способа определения активности ЛАП является его упрощение, сокращение времени, необходимого для проведения анализа.

Способ определения активности ЛАП основан на спектрофотометрическом определении количества β-нафтиламина, освобождающегося при действии аминопептидазы на синтетический субстрат Л-лейцил β-нафтиламид. По окончании необходимого времени инкубации исследуемой биологической жидкости с указанным субстратом ферментативная реакция останавливается путем добавления к смеси соляной кислоты, в которой растворена мочевина. Далее в пробирку вносят раствор нитрита натрия для диазотирования β-нафтиламина. Поскольку скорость диазотирования в данном случае значительно больше, чем скорость разрушения нитрита натрия мочевиной, то при избранных условиях определения все образовавшееся количество β-нафтиламина успевает полностью диазотироваться, т.е. на этом этапе определения активности ЛАП созданы условия для одновременного протекания двух реакций - диазотирования β-нафтиламина и разрушения избытка NaNO₂, мешающего проведению последующих этапов определения. Диазотированный β-нафтиламин в дальнейшем сочетают с N-(1-нафтил)-этилендиамином с образованием водорастворимого соединения синего цвета. Окрашенный раствор фотометрируют. Оптическая плотность окрашенных растворов пропорциональна концентрации β-нафтиламина, содержание которого, в свою очередь, пропорционально активности ЛАП в исследуемом материале.

При использовании нашего предложения представляется возможным, во-первых, изменить порядок прибавления реактивов (мочевину, т.е. реактив, разрушающий нитрит натрия, прибавлять до введения самого нитрита натрия), во-вторых, объединить раствор мочевины с соляной кислотой, т.е. сделать из них один рабочий раствор и, в-третьих, избавиться от одного фиксированного по длительности перерыва между отдельными этапами определения.

Предлагаемый способ определения активности лейцинаминопептидазы
Реактивы
1. Забуференный раствор субстрата - 0,00137 М раствор Л- лецил-β-нафтиламида гидрохлорида в 0,2 М фосфатном буфере (pH 7,0). Хранить в холодильнике при +5^oC. Раствор устойчив в течение месяца.

2. 0,05% раствор N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорида в 96^o этиловом спирте. Хранить в холодильнике при +5^oC. Оберегать от действия прямого солнечного света. Раствор устойчив по крайней мере в течение двух месяцев.

3. 8% раствор мочевины в 2н. HCl. Хранить в холодильнике при +5^oC. Раствор устойчив по крайней мере в течение двух месяцев.

4. 0,025% раствор нитрита натрия. Пригоден для использования в течение дня.

5. Стандартный 1,5 мг% раствор β-нафтиламина. Используется для построения калибровочной кривой. Хранить в холодильнике при +5^oC. Оберегать от света.

Ход определения
Определение активности лейцинаминопептидазы в сыворотке или плазме крови
1. В три пробирки прилить компоненты, приведенные в табл. 1.

Для всей группы одновременно проводимых определений достаточно одного контроля с субстратом (3-я пробирка).

2. Пробирки поместить в водяную баню с температурой +37^oC на 1 час.

3. После инкубации во все пробирки добавить по 0,5 мл раствора мочевины в 2н. HCl и их содержимое перемешать.

4. В каждую пробирку добавить по 1 мл 0,025% раствора нитрита натрия. Содержимое пробирок перемешать и оставить их стоять на столе при комнатной температуре на 6 минут.

5. Добавить в пробирки по 2 мл раствора N-(1-нафтил)-этилендиамина. Содержимое пробирок перемешать и оставить стоять на столе на 20 минут.

6. Измерить оптическую плотность раствора из каждой пробирки на спектрофотометре при λ = 585 ммк в кювете с 1 = 5 мм против воды. Окраска раствора устойчива не менее 2-х часов.

Если экстинкция раствора в 1-й пробирке окажется выше экстинкции стандартного раствора с максимальным содержанием β-нафтиламина (наивысшая точка на калибровочной кривой), то определение следует повторить, уменьшив время инкубации до 30 минут, а конечный результат определения соответственно увеличить в 2 раза. Активность ЛАП в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

где E - активность фермента, выраженная в мкМ, β-нафтиламина, образовавшегося в 1 мл сыворотки крови за 1 час;
A - количество образовавшегося β-нафтиламина (в мкМ) в 1-й пробирке за вычетом его количества во 2-й и 3-й пробирках (определить по калибровочному графику);
Б - степень разведения биологического материала;
0,5 - объем исследуемого материала в мл, как правило, разведенного;
t - время в часах.

При определении активности ЛАП в плазме крови допустимо использование в качестве антикоагулянтов гепарина, оксалата, цитрата и ЭДТА. Билирубин (до 20 мг%) и гемоглобин (до 0,2%) практически не мешают проведению определения активности ЛАП в сыворотке крови.

Определение активности лейцинаминопептидазы в моче
Моча перед определением в ней активности ЛАП подвергается диализу, который проводится в целлофановых мешочках. Целлофановую трубку (имеется в наборе) длиной 25-30 см смачивают водой с последующим тщательным удалением остатков жидкости. Один конец трубки завязывают и в образовавшийся мешочек наливают 25 мл отцентрифугированной мочи. (Порция мочи для исследования отбирается из ее суточного объема). Затем завязывают верхний конец мешочка, подвешивают его на стеклянную палочку и погружают в сосуд с проточной холодной водопроводной водой. Диализ продолжается примерно 8 часов. По окончании диализа измеряют объем диализированной мочи и вычисляют поправочный коэффициент K:

где V - объем диализированной мочи,
25 - первоначальный объем мочи в мл.

Диализированная моча разводится водой в 15 раз и далее в ней определяют активность фермента по той же схеме, что и для сыворотки крови.

При расчете активности ЛАП в моче производят определение активности фермента по той же формуле, что и для сыворотки крови (см. п. 6), а затем полученный результат умножают на поправочный коэффициент K и на количество суточной мочи в мл.

Определение активности лейцинаминопептидазы в дуоденальном соке
При исследовании дуоденального сока (собранного в пробирки малыми порциями) отбирают и соединяют вместе лишь порции, обладающие характерными свойствами - слабощелочной реакцией на лакмус, золотисто-желтой окраской и прозрачностью. Обнаруживаемую в пробах слизь отделяют центрифугированием. Дуоденальный сок разводят дистиллированной водой и последующее определение активности фермента производят так же, как и при исследовании сыворотки крови (пп. 1-6).

Построение калибровочного графика
В 6 пробирок отмеривают количества стандартного раствора и воды, приведенные в табл. 2.

Далее в каждой пробирке проводят цветную реакцию с β-нафтиламином и последующее определение экстинкции окрашенных растворов (см. ход определения активности фермента в сыворотке крови, пп. 3-6). Полученные результаты используют для построения калибровочного графика: по оси абцисс откладывают значения содержания β-нафтиламина в каждой пробирке, выраженные в мкМ, а по оси ординат - значения экстинкции соответствующих растворов.

Предлагаемый способ определения активности ЛАП более прост в исполнении, чем известный способ-прототип Гольдбарга-Рутенберга [2] в модификации Мартинека с соавт. [3]. В нем уменьшено количество рабочих растворов, сокращено число дозирующих процедур, а количество фиксированных перерывов между отдельными этапами уменьшено до одного, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ.

Источники информации
1. Nagel W., Willig F., Schmidt F.H. // Klin. Wschr. - 1964. - Vol. 42. - P. 447-449.

2. Goldbarg J., Rutenburg A. //Cancer. - 1958. - Vol.11. - P.283.

3. Martinek R.G., Berger L., Broida D. //Clin. Chem. - 1964. - Vol. 10. - P. 1087.

4. Reagents for determination of leucine aminopeptidase. Kit N. 251-A. Sigma Chemical Company (USA).

Изобретение относится к медицине, в частности к методам лабораторной диагностики заболеваний. Способ заключается в том, что исследуемый материал с добавленным к нему забуферным раствором субстрата Л-лейцил-β-нафтиламида инкубируют при 37^oC, по окончании заданного времени инкубации ферментативную реакцию останавливают путем добавления к смеси соляной кислоты, образовавшийся в результате ферментативной реакции β-нафтиламин диазотируют с помощью раствора нитрита натрия, избыток которого разрушают добавлением к реакционной смеси раствора соответствующего вещества, и затем диазотированный β-нафтиламин сочетают с N-(I-нафтил)-этилендиамином дигидрохлоридом с образованием соединения синего цвета, после чего измеряют оптическую плотность окрашенного раствора. Новым в предлагаемом способе является то, что для разрушения избытка нитрита натрия используют мочевину, причем диазотирование β-нафтиламина и разрушение избытка нитрата натрия проводят одновременно и применяют для этого раствор мочевины в соляной кислоте. Способ позволяет уменьшить количество рабочих растворов, сократить число дозирующих процедур, а количество фиксированных перерывов между отдельными этапами уменьшено до одного. 2 табл.

Способ определения активности лейцинаминопептидазы, согласно которому исследуемый материал с добавленным к нему забуференным раствором субстрата Л-лейцил-β-нафтиламида инкубируют при 37^oC, по окончании заданного времени инкубации ферментативную реакцию останавливают путем добавления к смеси соляной кислоты, образовавшийся в результате ферментативной реакции β-нафтиламин диазотируют с помощью раствора нитрита натрия, избыток которого разрушают добавлением к реакционной смеси раствора соответствующего вещества, и затем диазотированный β-нафтиламин сочетают с N-(1-нафтил)-этилендиамином дигидрохлоридом с образованием соединения синего цвета, после чего измеряют оптическую плотность окрашенного раствора, отличающийся тем, что для разрушения избытка нитрита натрия используют мочевину, причем диазотирование β-нафтиламина и разрушение избытка нитрита натрия проводят одновременно и применяют для этого раствор мочевины в соляной кислоте.