Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

1

Изобретение относится к меди- . цине, в частности к методам определения лекарственных препаратов в биологических жидкостях, и касается способа определения аминоглютетимида. 5

Цель изобретения - упрощение и

повышение точности способа.

Цель достигается за счет проведения диазотирования аминоглютетимида и азосочетания с 0,05%-ным Ы-(1-наф- тил)-этилендиамин-дигидрохлоридом (НЭД) . Полученное диазо производное аминоглютетимида определяют спектро- 1 фотометрически (или фотометрически)

при длине волны 560 нм.

Способ осуществляется следующим

образом.

В центрифужные пробирки, содержащие 1,4 мл дистиллированной воды, приливают по 0,1 мл крови или мочи (предварительно разведенной в 5 раз), перемешивают и приливают 0,5 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешивают, оставляют

10

15

20

5

10

15

20

на 5-10 мин, центрифугируют 20 мин 3000 об/мин. Центрифугат разливают в две пробирки (не очень широкие) по 0,5 мл, прибавляют в каждую по 0,1 мл 4 н. НС1 и перемешивают. Одну из пробирок закрывают фольгой и ставят в кипящую водяную -баню на 45 мин. Все пробирки (гидролизован- ные и негидролизованные) охлаждают в обычном холодильнике при 4 С в течение 30 мин, затем прибавляют по 0,1 мл свежеприготовленного 0,2%- ного NaNO, встряхивают, через 4 мин приливают 0,1 мл 1%-ного аммония сульфановокислого, встряхивают, через 2 мин приливают 0,2 мл 0,05%-ного НЭД, встряхивают, ставят на 1 ч в темное место, периодически энергично встряхивают. Фотометрируют при Л 560 нм, путь луча 1 см. Количество аминоглютетимида рассчитывается по калибровочной кривой. Для ее построения в пробы вместо крови или мочи

(Л

ел ел

00

о

31455307

приливают О,1 мл стандартного раство- фаминовокислого, а через 2 мин провели азосочетание,. приливая 0,2 мл 0,05%-ного Н-( 1-нафтил)-этш1ендиаминра с известным содержанием аминоглю- тетимида от 1,0 до 10 мкг (табл.1). I По стандартной кривой находят количество аминоглютетимида, соответствующее полученной экстинкции при определении, т.е. количество аминоглютетимида в мкг, содержащееся в : О,1 мл крови (или В мг В 100 мл I крови), а для мочи это количество умножается на разведение мочи в 5 раз и на суточный объем мочи.

При обследовании животных и человека, принимавших аминоглютетимид, были получены результаты, представленные в табл, 2.

Аминоглютетимид вводили животньм внутрибрюшинно натощак в -количестве 20 мг на 1 кг веса, кровь брали в гепаринизированные пробирки через 2 ч после введения.

В лечебных целях аминоглютетимид применяли per os по 250 мг 4 раза в сутки, кровь брали утром натощак через 2 ч после последнего приема препарата.

Мочу в обоих случаях собирали в течение суток.

П р и м е р 1. Определение концентрации аминоглютетимида в крови.

У человека, принимающего в лечебных целях аминоглютетимид, взяли 0,1 мл крови из пальца утром натощак, внесли её в центрифужную пробирку, содержащую 1,4 мл дистиллированной воды, перемешали и прилили 0,5 мл 20%-ной -трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешали стеклянной палочкой и центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Центрифугат разлили по 0,5 мл в 2 пробирки (не очень широкие) с внутренним диаметром 8-10 мм, чтобы не было значительного испарения проб при нагреве), В обе пробирки приливали по 0,1 мл 4 н. НС1, перемешали, одну из них закрыли фольгой и поставили в водяную баню (кипящую) на 45 мин, другую оставили при комнатной температуре. Через 45 мин пробу вынули из водяной бани, некоторое время охлаждали на возбухе и обе пробирки поместили в обычньй холодильник () на 30 мин, после чедигидрохлорида. Пробы оставили на

1 ч в темноте, периодически встряхивая для удаления пузырьков газа. Через 1 ч их фотометрировали при длине волны 560 нм. В гидролизованной бе определили общий аминоглютетимид, в негидролизованной - свободный, т.е. неацетилированный, аминоглютетимид. По разности между общими и свободным аминоглютетимидом определили количе15 ство ацетиламиноглютетимида. Расчет вели по калибровочной кривой со стандартными растворами аминоглютетимида, содержащими 1,25; 2,5; 5,0; 7,5 мкг аминоглютетимида в О,1 мл крови.Например, величина экстинкции в гидролизованной пробе 0,190, что соответствует по стандартной кривой 3,5 мкг, а в негидролизованной - 0,120, что соответствует 2,5 мкг, следовательно,

25 количество общего аминоглютетимида в крови равно 3,5 мг в 100 мл, а свободного - 2,5 мг в 100 мл, коли- честно ацетилированного аминоглютетимида 1,0 мг в 100 мл,

20

30

35

40

Пример 2. Определение концентрации аминоглютетимида в моче.

У человека, принимающего аминоглютетимид, собрали суточную мочу, развели ее дистиллированной водой в 5 раз и О,1 мл разведенной мочи -обработали так же, как 0,1 мл крови (см. пример 1). При расчете получен- ньй результат умножили на разведение мочи и на суточный объем мочи.

Формула изобретения

Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости, путем

определения белка, обработки супер- натанта реагентами с последующей спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повьш1ения точности способа,

50 супернатант разделают на две пробы, обрабатывают их трихлоруксусной кислотой, затем одну из проб гидролизу- ют при кипячении, в качестве реагентов используют азотистокислый натго провели диазотирование путем при- 55 рий и N (1-нафтил)-этилендиамин-ди- бавления в пробы по OJ мл 0,2%-ного гидрохлорид, обработку которыми NaNO, через 4 мин- убрали избыток нитрита 0,1 мл 1%-ного аммония сульпроводят последовательно в течение не именее четырех минут первым и

фаминовокислого, а через 2 мин провели азосочетание,. приливая 0,2 мл 0,05%-ного Н-( 1-нафтил)-этш1ендиаминдигидрохлорида. Пробы оставили на

1 ч в темноте, периодически встряхивая для удаления пузырьков газа. Через 1 ч их фотометрировали при длине волны 560 нм. В гидролизованной пробе определили общий аминоглютетимид, в негидролизованной - свободный, т.е. неацетилированный, аминоглютетимид. По разности между общими и свободным аминоглютетимидом определили количество ацетиламиноглютетимида. Расчет вели по калибровочной кривой со стандартными растворами аминоглютетимида, содержащими 1,25; 2,5; 5,0; 7,5 мкг аминоглютетимида в О,1 мл крови.Например, величина экстинкции в гидролизованной пробе 0,190, что соответствует по стандартной кривой 3,5 мкг, а в негидролизованной - 0,120, что соответствует 2,5 мкг, следовательно,

количество общего аминоглютетимида в крови равно 3,5 мг в 100 мл, а свободного - 2,5 мг в 100 мл, коли- честно ацетилированного аминоглютетимида 1,0 мг в 100 мл,

30

35

40

Пример 2. Определение концентрации аминоглютетимида в моче.

У человека, принимающего аминоглютетимид, собрали суточную мочу, развели ее дистиллированной водой в 5 раз и О,1 мл разведенной мочи -обработали так же, как 0,1 мл крови (см. пример 1). При расчете получен- ньй результат умножили на разведение мочи и на суточный объем мочи.

Формула изобретения

Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости, путем

определения белка, обработки супер- натанта реагентами с последующей спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повьш1ения точности способа,

50 супернатант разделают на две пробы, обрабатывают их трихлоруксусной кислотой, затем одну из проб гидролизу- ют при кипячении, в качестве реагентов используют азотистокислый натрий и N (1-нафтил)-этилендиамин-ди- гидрохлорид, обработку которыми

проводят последовательно в течение не именее четырех минут первым и

51А553076

не менее часа - вторым, а аминоглю- тинкции гидролизованной и негидроли- етимид определяют как разность в экс- зованной проб при длине волны 360 им.

I

Таблица 1

Величина экстинкции при определении аминоглютетимида в стандартных растворах с разной концентрацией N-(1- нафтил)-этилендиамин-дигидрохлорида

Изобретение относится к медицине, касается методов определения лекарственных препаратов, например ами- ноглютетимида, в биологических жидкостях. С целью упрощения и повышения точности способа проводят диазо- тирование аминоглютетимида и азосо- . четание с 0,05%-ным К-(1-нафтил)- этилендиамин-дигидрохлоридом. Полученное диазопроизводное аминоглютетимида определяют спектрофотометри- чески (или фотометрически) при 7( 560 нм. 2 табл.

Таблица2