СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ КРОВИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам диагностики гиперкоагуляции крови, основанным на принципе рекальцификации цитратной крови, и может применяться в клинических лабораториях лечебных учреждений.

В медицине известны лабораторные способы исследования свертывания крови в условиях низкоконтактной активации, основанные на принципе рекальцификации цитратной крови (Исследование системы гемостаза в клинике. Под ред. Баркагана З. С. , Барнаул, 1975, с. 21, 72-73; Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. Минск, 1983, с. 120-124; Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под ред. Балуды В.П. и соавт. Томск, 1980, с. 55-56, 127). Указанные способы считаются одними из основных в гемостазиологии. Однако накопившийся опыт и расширение знаний в области механизмов свертывания крови показали, что эти способы по своей чувствительности перестали удовлетворять все возрастающим требованиям к выявлению гиперкоагуляции (Rohrer M.J. et al. Annls of Surgery, 1988, vol. 208, N 5, p. 554-557).

Наиболее близким техническим решением является способ диагностики гиперкоагуляции, основанный на исследовании свертывания крови в условиях низкоконтактной активации (Суханов В. А. и Коряков И.О. Лабораторное дело, 1985, N 12, с. 722-724). Способ заключается в том, что кровь исследуемого индивидуума забирают в силиконированную (или пластиковую) пробирку, где ее смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия (Na₃C₆H₅O₇ ˙2H₂O) в соотношении 9: 1. К цитратной крови, взятой в количестве 0,66 мл, добавляют 0,075 мл 1,29% раствора хлорида кальция. Это позволяет достичь сбалансированной рекальцификации, т.е. восстановить исходное количество ионизированного кальция в исследуемой крови. По укорочению времени свертывания в сравнении с нормой диагностируют гиперкоагуляцию крови.

Недостатком известного способа является его относительно низкая чувствительность к выявлению гиперкоагуляции крови. Несмотря на то, что сейчас обязательным условием проведения коагулологических исследований является использование силиконированной или пластиковой лабораторной посуды, снижающей выраженность контактной активации гемокоагуляции, тем не менее, относительно мощная активация свертывающей системы in vitro за счет контакта с чужеродной для нее поверхностью остается весьма существенным источником лабораторной погрешности и низкой чувствительности к существующим in vivo активаторам гемокоагуляции у способов, интегрально оценивающих состояние данной системы. Немаловажным фактором, способствующим низкой чувствительности этих способов, является и то, что в крови человека содержание прокоагулянтов значительно превышает уровень, необходимый для обеспечения ее свертывания (Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под ред. Балуды В.П. и соавт. Томск, 1980, с. 29-30). Таким образом, контактная активация крови in vitro на фоне перенасыщения крови прокоагулянтами маскирует влияние на свертывающую систему активаторов гемокоагуляции, образовавшихся in vivo и присутствующих в циркулирующей крови.

Целью предложенного способа является повышение его чувствительности путем уменьшения влияния активированных in vitro факторов свертывающей системы крови.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе диагностики гиперкоагуляции крови, заключающемуся в том, что исследуемую кровь смешивают с раствором цитрата натрия, к цитратной крови добавляют 1,29% раствор хлорида кальция и по укорочению времени свертывания крови относительно нормы диагностируют ее гиперкоагуляцию, новым является то, что раствор хлорида кальция и цитратную кровь берут в объемном соотношении 0,040: 0,66.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что раствор хлорида кальция и цитратную кровь берут в новом соотношении 0,040:0,66. Таким образом, заявленный способ соответствует критерию изобретения "новизна". При изучении других технических решений в области медицины признак, отличающий заявленное решение от прототипа, не был выявлен. Заявленное соотношение проявляет и новое свойство, а именно - повышает чувствительность способа в такой степени, что появляется возможность определить достоверный критерий гиперкоагуляции. Математический анализ показал, что с помощью известного способа невозможно получить надежный критерий гиперкоагуляции. Исходя из указанного, заявленный отличительный признак обеспечивает заявленному техническому решению соответствие критерию изобретения "Существенные отличия".

К заявленному соотношению смешиваемых объемов цитратной крови и хлорида кальция пришли эмпирически, постепенно уменьшая в данном соотношении количество 1,29% раствора хлорида кальция с 0,075 мл. Было выявлено, что 0,040 мл 1,29% раствора хлорида кальция - это наименьшее количество ионизированного кальция, которое обеспечивает свертывание цитратной крови в пределах, удобных для исследователя величин при относительно небольшой дисперсии показателей в норме. Дальнейшее уменьшение количества добавляемого хлорида кальция, например до 0,035 мл 1,29% раствора, приводит к резкому удлинению времени свертывания в норме вплоть до отсутствия свертывания в ≈ 3% случаев. Кроме того, дисперсия времени свертывания в норме возрастает примерно в 10,4 раза, что значительно увеличивает процент получения ошибочных результатов за счет лабораторной погрешности.

Для выявления положительного эффекта заявленного технического решения в сравнении с прототипом были проведены следующие исследования. Исследуемые индивидуумы были поделены на три группы. К первой группе были отнесены 232 пациента, в патогенезе заболеваний которых важную роль играет гиперкоагуляция крови. Вторую группу составили 54 здоровых человека. Третья группа была образована из 60 пациентов, у которых предположительно имела место гипокоагуляция вследствие проводимой им гепаринотерапии. Для краткости условились называть эти группы "гипер", "норма" и "гипо" соответственно.

В табл. 1 показаны элементарные статистические характеристики времени свертывания крови при проведении сбалансированной, т.е. 0,075-рекальцификации, и заявляемого технического решения, т.е. 0,040-рекальцификации.

Как видно из табл.1, среднее время свертывания при 0,040-рекальцификации, естественно, превышает среднее время свертывания при сбалансированной рекальцификации в каждой исследуемой группе. Разброс значений времени свертывания, характеризуемый средне-квадратичным отклонением (СКО), также больше при 0,040-рекальцификации.

Поскольку рассматриваемые гемокоагуляционные тесты естественно характеризовать (и использовать) в терминах доверительных интервалов, необходимо было исследовать эмпирические распределения времени свертывания. Как показывают значения колмогоровской статистики z, эти распределения оказываются нормальными с очень высокими уровнями значимости 1-k(z). Это позволило применить стандартные методы построения доверительных интервалов для стьюдентовских распределений.

Для обоих значений С хлорида кальция (т.е. С=0,075 и С=0,040) и для каждой из трех групп был вычислен доверительный интервал уровня γ/γ =0,8; 0,9; 0,95; 0,99; 0,995). (Следует указать, что эти интервалы являются априорными для вновь исследуемых в будущем индивидуумов). При этом для группы "норма" строились кратчайшие двусторонние интервалы, для других групп - односторонние (нижний - для "гипер", верхний - для "гипо"). Результаты вычислений представлены в табл.2.

На фиг. 1 и 2 представлены плотности распределений вероятности времени свертывания крови в каждой из трех исследуемых групп (на фиг.1 С=0,075; на фиг. 2 С= 0,040). На каждом из графиков по оси абсцисс - время свертывания крови в секундах. В верхней части каждого графика горизонтальными прямыми изображены 0,9-доверительные интервалы для соответствующих групп. На фиг.1 и 2 кривая 1 показывает плотности распределений вероятности времени свертывания крови для группы "гипер"; кривая 2 - для группы "норма"; кривая 3 - для группы "гипо".

Результаты исследований, приведенные в таблицах и на графиках, показывают, что при С=0,075 для любого "разумного" доверительного уровня γ, доверительные интервалы всех трех групп существенно перекрываются, не обеспечивая распознавания образов "гипер", "норма" и "гипо". На эту нераспознаваемость указывают и крайне низкие значения мощности критерия нормальности, построенного на базе кратчайшего доверительного интервала группы "норма" (см. последний столбец табл.2).

Напротив, при С=0,040 картина качественно иная: 0,9-доверительные интервалы трех групп разделены. Даже при γ=0,95 интервалы имеют лишь незначительное перекрытие. Хорошая распознаваемость при этом доверительном уровне демонстрируется и значением мощности: ошибка 2-го рода для критерия "нормальности" все еще остается менее вероятной, нежели ошибка 1-го рода. Из табл.2 видно, что критерием гиперкоагуляции с большой степенью достоверности может считаться время свертывания 760 с и меньше.

Таким образом, результаты проведенного сравнительного исследования показывают высокую чувствительность заявленного способа диагностики гиперкоагуляции крови.

П р и м е р. У больного забирают кровь в силиконированную (или пластиковую) пробирку, где находится 3,8% раствор цитрата натрия (Na₃C₆H₅O₇ 2H₂O). Соотношение крови и цитрата натрия составляет 9:1. Для исследования времени свертывания берут 0,66 мл цитратной крови, смешивают с 0,040 мл 1,29% раствора хлорида кальция и включают секундомер. Смесь тщательно перемешивают, после чего 0,36 мл этой смеси вносят в кювету тромбоэластографа (гемокоагулограф ГКГМ4-02) и включают запись процесса регистрации свертывания крови. Одновременно выключают секундомер и время, показанное на секундомере, суммируют со временем, регистрируемым прибором. Время свертывания крови определяют по величине r на тромбоэластограмме. В случае, если время свертывания меньше или равно критическому значению 760 с, то диагностируют гиперкоагуляцию крови.

Заявленный способ диагностики гиперкоагуляции обладает в сравнении с прототипом следующими преимуществами:
позволяет диагностировать гиперкоагуляцию крови с высокой степенью достоверности;
устанавливает критерий гиперкоагуляции крови.

Использование: медицина, гематология. Сущность изобретения: цитратную кровь и 1,29% раствор хлорида кальция смешивают в объемном соотношении 0,66 : 0,040 и регистрируют время свертывания крови, помешенной в тромбоэластографе, и при уменьшении времени свертывания относительно нормы определяют гиперкоагуляцию. 2 ил., 2 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ КРОВИ, включающий смешивание пробы крови с раствором цитрата натрия, добавление 1,29% CaCl₂ с последующей регистрацией на термобоэластографе времени свертывания и сравнением полученного показателя с нормой, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, раствор хлорида кальция и цитратную кровь смешивают в объемном соотношении 0,040 : 0,66.