ШТАММ БАКТЕРИЙ ARTHROBACTER CRYSTALLOPOICTES - ДЕСТРУКТОР ПИРИДИНА Российский патент 1994 года по МПК C12N1/00 C02F3/34 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма, который может найти применение при биологической очистке промышленных сточных вод ряда производств микробиологической и медицинской промышленности от высокотоксичного пиридина, а также образующего в качестве промежуточных продуктов деградации 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридины - синтоны в синтезе ряда ценных физиологически активных соединений.

Известен штамм Nocardia sр. Z-1, использующий пиридин в качестве источник углерода и азота в концентрации до 0,1 об.%.

К недостаткам данного штамма можно отнести следующие:
рост при более низких концентрациях пиридина;
медленную утилизацию субстрата;
неспособность образовывать гидроксипроизводные пиридина.

Известен штамм Corynebacterium sр., утилизирующий пиридин в концентрации до 0,15 об.%.

К недостаткам данной культуры можно отнести следующие:
потребность в дополнительном источнике азота;
неспособность образовывать гидроксипроизводные пиридина.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является штамм Nocardia р. КМ-2, который способен утилизировать пиридин и образовывать в качестве промежуточного соединения 3-гидроксипиридин.

К недостаткам данного штамма можно отнести неспособность образовывать 2,3-дигидроксипиридин, который является более ценным препаратом.

Целью изобретения является выделение нового штамма бактерий, утилизирующих пиридин с образованием в качестве промежуточных продуктов 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридинов. Эти соединения могут быть использованы как синтоны в синтезе ряда ценных физиологически активных веществ.

Это достигается выделением штамма Аrthrobacter crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д из накопительной культуры микроорганизмов - деструкторов пиридиновых соединений, полученной из образцов почвы, взятых с территории химико-фармацевтического завода.

Для выделения использовали синтетическую среду. В качестве источника углерода и азота использовали пиридин. Чистую культуру выделяли из отдельной колонии, полученной путем рассева накопительной культуры на чашки с агаризованной синтетической средой с пиридином.

Штамм хранят как методами лиофилизации и криоконсервации, так и субкультивированием. Штамм Аrthrobacter crystalloрoietes депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМ Ас-1334Д, непатогенен.

Морфологические и культуральные признаки.

Клетки грамположительные, неподвижные, бесспоровые, некислотоустойчивые. Во время роста наблюдаются морфологические изменения клеток: молодая культура (12-24 ч) состоит из палочек, слегка изогнутых, собранных в короткие цепочки по 2-3, образующих Х,Y,V-образные структуры. Старые культуры (2-7 дней) состоят главным образом из кокковидных клеток. При пересеве на свежую среду рост происходит путем увеличения кокковидных клеток. Размеры клеток 0,5-0,8х1,2-4,0 мкм. На агаризованной синтетической среде с пиридином культура однородна, колонии круглые, блестящие, гладкие, выпуклые, сначала белесые, но при старении желтеют, размер 0,5-3,0 мм, пастообразной консистенции, с ровным краем, вырастают за 48 ч. На МПА вид колоний не менялся, однако их размер был больше (1-4 мм), вырастают за 36 ч. В жидкой синтетической среде с пиридином штамм растет, образуя муть, небольшой осадок, который при взбалтывании легко взмучивается. Наблюдается образование желтого пигмента. На МПБ образуется светло-желтая пленка, небольшой осадок.

Физиолого-биохимические признаки.

Строгий аэроб, оптимальная температура роста 28-30^оС, максимальная 42^оС, минимальная 12-15^оС. Оптимум рН 7,0-7,2. Каталазо- и оксидазоположителен. Не образует кислот при росте на глюкозе, галактозе, фруктозе, мальтозе, арабинозе, рибозе, ксилозе, сахарозе, рафинозе, манните, глицерина, сорбите, дульците. Не образует индола и сероводорода. Нитраты восстанавливает, желатину не разжижает, тирозин не расщепляет, крахмал не гидролизует, образует уреазу. Усваивает пропионат, сукцинат, ацетат, малеат, слабо цитрат, не усваивает оксалоацетат. Клеточная стенка содержит лизин, менахиноны - 9 (Н₂). Признаки штамма устойчивы. В факторах роста не нуждается. Антибиотики - тетрациклин, ампициллин абсолютно подавляют рост штамма. Сильно подавляют рост рифампицин, канамицин, стрептомицин.

Клетки штамма А. crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д содержат две плазмиды рВS320 и рВS321 с мол.м. 100 и 80 мДа соответственно. Опытами по элиминации и коньюгации доказано, что плазмида рВS321 (80 мДа) отвечает за способность к деградации пиридина данным штаммом. Митомицин С в концентрации 0,1 мкг/мл, додецилсульфат натрия (0,002%) вызывают элиминацию плазмиды рВS321 из клеток с одновременной потерей способности к деградации пиридина. Плазмида рВS321 коньюгативна и переносится в клетки штамма Аrthrobacter crystalloрoietes В-495 с частотой 10^-7 на клетку донора.

П р и м е р 1. Деградация пиридина в колбах при аэрации.

Штамм А. crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д выращивают на синтетической среде, используя в качестве источника углерода и азота пиридин. Культивирование проводят в качалочных колбах с 200 мл среды при 28-30^оС на качалке 200 об/мин.

Получение посевного материала культуры для утилизации пиридина осуществляют следующим образом. Культуру штамма, хранившуюся на синтетической агаризованной среде с пиридином (1 г/л), переносят в пробирки с 10 мл среды, где содержится 1,5 г/л данного субстрата. Полученный посевной материал переносят в колбы с 200 мл среды с пиридином (1,5 г/л). В качестве посевного материала используют также жидкую культуру, хранившуюся в мицелиальных пробирках. Выращивание культуры проводят в течение 44-48 ч.

Полноту потребления пиридина определяют в подкисленной НСl до рН 2,0-3,0 и отделенной от биомассы центрифугированием культуральной жидкости на спектрофотометре, а также с помощью хромато-масс-спектрометрии. Динамика деструкции пиридина культурой А.crystalloрietes ВКМ Ас-1334Д приведена в таблице.

П р и м е р 2. Идентификация гидроксипиридинов в качестве промежуточных продуктов деградации пиридина штаммом А.crystalloрoietes ВКМ Ас-1334Д.

Культуральная жидкость, полученная в объеме 1 л и отделенная от клеток центрифугированием, экстрагировалась при нейтральном рН хлороформом в течение 30 ч. Хлороформенный экстракт упаривали в вакууме досуха, остаток растворяли в 0,5 мл этанола и хроматографировали в системе хлороформ - ацетон - этанол (7:2:2) на силикагеле РSС Fertigрlatten Kieselgel 60 F₂₅₄ Меrok. Из полосы с Rf=0,7 был выделен 3-гидроксипиридин, из полосы с Rf=0,4 - - 2,3-дигидроксипиридин. 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридины были выделены в количествах 1,5 и 2,0 мг соответственно (выход 0,1%).

Идентификацию этих соединений приводили в виде ТМС-производных на хромато-масс-спектрометре "Varian-МАТ-212" при энергии ионизации 70 эВ.

Масс-спектры выделенных соединений (в скобках указана интенсивность в % к максимальному иону) следующие:
3-гидроксипиридин в виде ТМС-производного: 167(62) М⁺, 152(100), 136(4), 122(5), 78(4), 73(11);
2,3-гидроксипиридин в виде моно-ТМС-производного: 183(30) М⁺, 168(17), 155(4), 150(5), 139(15), 112(4), 73(100);
2,3-дигидроксипиридин в виде бис-ТМС-производного: 255(3) М⁺, 240(10), 225(49), 156(6), 103(74), 96(15), 73(100).

Кроме того, время удерживания (Rt) 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридинов идентично таковому для синтетических свидетелей.

Использование: получение нового штамма, применяющегося при биологической очистке промышленных сточных вод ряда производств микробиологической, коксохимической и медицинской промышленности от пиридина, а также образующего в качестве промежуточных продуктов деградации 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридина - синтоны в синтезе ряда физиологически активных соединений. Сущность изобретения: штамм Arthrobacter crystallopoietes ВКМ Ас-1334 D разрушает пиридин и образует в качестве промежуточных продуктов 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридины. Штамм Arthrobacter crystallopoietes ВКМ Ас-1334Д выделен из накопительной культуры микроорганизмов-деструкторов пиридиновых соединений, полученной из образцов почвы с территории химико-фармацевтического завода. Данный штамм утилизирует пиридин в качестве единственного источника углерода и азота в концентрации до 1,5 г/л за 48 ч и образует 3-гидрокси- и 2,3-дигидроксипиридины с выходом 0,1% к 24 ч роста культуры. 1 табл.

Штамм бактерий Arthrobacter crystallopoietes ВКМ Ас = 1334 D - деструктор пиридина.