КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ: AEROMONAS SPECIES, ALCALIGENES DENITRIFICANS, ARTHROBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ПОЧВОГРУНТОВ, ВОД ОТ НЕФТИ, НЕФТЕПРОДУКТОВ И ОСТАТОЧНОЙ ЗАМАЗУЧЕННОСТИ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/01 C12R1/05 C12R1/06 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промпредприятий и других объектах.

Цель изобретения - получение консорциума микроорганизмов - деструкторов нефти для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяного загрязнения и остаточной замазученности.

Для достижения поставленной цели выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (Морской торговый порт г. Находка), консорциум микрорганизмов-деструкторов: Aeromonas species КММ НФ 5-2 (КММ НФ - коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов): Aeromonas species КММ НФ 5-9; Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-1; Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-11; Arthrobacter species КММ НФ 5-7. Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов.

Выделенные штаммы микроорганизмов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера: ВКМ В - 2047Д, ВКМ В - 2048Д, ВКМ В - 2049Д, ВКМ В - 2050Д, ВКМ В - 2051Д соответственно.

Консорциум штаммов бактерий берут в количествах:
Aeromonas species штамм КММ НФ 5-2 - 30%
Aeromonas species штамм КММ НФ 5-9 - 30%
Alcaligenes denitrificans штамм КММ НФ 5-1 - 15%
Alcaligenes denitrificans штамм КММ НФ 5-11 - 15%
Arthrobacter species штамм КММ НФ 5-7 - 10%
Характеристика штамма Aeromonas species КММ НФ 5-2.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки с закругленными концами, почти овальные, размером 0,8 х 1,5 ммк, подвижные, грамотрицательные, сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательной и бродильный, оксидазо- и каталазоположительные. Гидролизуют казеин, желатин, крахмал. Утилизируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, трегалозу. Сорбозу, ксилозу не сбраживают. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.

Характеристика штамма Aeromonas species КММ НФ 5-9.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки с закругленными концами, размером 0,8 х 1,5 ммк, подвижные, грамотрицательные, сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный и бродильный. Оксидазо- и каталазоположительные. Гидролизуют казеин, желатин, крахмал. Утилизируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, трегалозу. Сорбозу, ксилозу не сбраживают. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.

Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-1.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 1,0 х 1,8 ммк, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие, полупрозрачные выпуклые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный, оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин- 80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.

Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 5-11.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 0,5 х 1,2 ммк, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют небольшие, гладкие, выпуклые слизистые полупрозрачные колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный, оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин- 80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.

Характеристика штамма Arthrobacter species КММ НФ 5-7.

Морфолого-культуральные признаки. Короткие палочки с возрастом укорачиваются до кокков, диаметром 10 ммк, грамположительные. На плотных питательных средах образуют округлые, гладкие блестящие, беловатые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Желатин гидролизуют. Крахмал, твин- 80 не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35^oC, pH 7,0 - 7,5, не патогенен.

Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде следующего состава, г/л: NH₄NО₃ - 1,0, K₂HPO₄ - 1,0, KH₂PO₄ - 1,0, MgSO₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,02, FeCl - 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная - 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта.

Оптимальная температура роста 25 - 30^oC, pH 7,0 - 7,2 (Ворошилова, Дианова. Микробиология, т. 31, вып. 4, 1952).

Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: K₂HPO₄ - 10,0, KH₂PO₄ - 1,0, NH₄NО₃ - 2,0, вода дистиллированная - 1000 мл, нефтепродукт - 10 мл (Дядечко, Толстокорова, Морозова. А.с. N 1076446, 1984).

Среда, состоящая из 0,3% водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%, способствует активному нарастанию биомассы консорциума.

Заявленный консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательные среды. Обычно выделенные штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов имеют невысокую активность, поэтому необходимо повысить их активность путем адаптации.

Адаптацию нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов в среде проводят путем частых пересевов на свежую питательную среду. Делают это для того, чтобы в питательной среде не происходило накопление токсических метаболитов микробного происхождения и чтобы выделить более устойчивые особи нефтеокисляющих микроорганизмов, т.к. ослабленные клетки гибнут или плохо растут. Интенсивный рост дают только клетки физиологически активные. Таким образом проводят отбор активных клеток и получают консорциум.

Методом математического анализа установлено, что в данном консорциуме бактерии рода Aeromonas являются доминирующими видами и типично часто встречаемыми формами бактерий - до 60% всех микроорганизмов в популяции нефтеокислителей. Бактерии рода Alcaligenes относятся к содоминантным видам (30% от общего числа бактерий консорциума). Arthrobacter species КММ НФ 5-7 относится к типично редкому виду по встречаемости и составляет 10%.

Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению CO₂.

В колбы емкостью 500 мл, последовательно герметично соединенные, вносят поглотитель углекислоты BaOH. В колбу с инокулянтом вносят 250 мл среды Ворошиловой - Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,0•10⁵ кл/мл. Подачу атмосферного воздуха проводят с помощью дозатора А - 2 со скоростью 34 мл/мин. Для того, чтобы в колбу с инокулянтом не поступал CO₂, воздух пропускает через 2 колбы с поглотителем CO₂, и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов аэрируемый воздух дополнительно проходит через 2 колбы с поглотителем CO₂, далее BaOH оттитровывают HCl и определяют окислительную способность по количеству выделенного углекислого газа. Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один с реактивами, без консорциума и нефтепродуктов, другой с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание CO₂ не обнаружено. Длительность опыта 30 суток. Окислительная активность консорциума составляет 2041 мг CO₂.

Таким образом, предлагаемый консорциум штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов обладает более высокой скоростью окисления нефтепродуктов.

Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве размером 10 х 10 м, глубиной загрязнения 0,1 -0,2 м с содержанием нефтепродуктов 20% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор, калий сбалансированы по 17%, растворяют в 200 л воды. Загрязненный участок поливают водным раствором нитроаммофоски (1 л/м²) за 2 дня до вспашки. После вспашки через 2 дня вносят дополнительно водный раствор нитроаммофоски. Норма полива 1 л/м². Эта операция необходима для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,0 • 10¹² клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м². Через месяц содержание нефтепродукта в почве составляет 11%, через 2 месяца - 4%, через 3 месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.

Таким образом, преимуществом предлагаемого консорциума штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты, что позволяет эффективно использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами и остаточной замазученностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Консорциум выделен из почв прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Он представляет собой природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов. Окислительная активность консорциума по конечному продукту окисления составляет 2041 мг CO₂ за 30 суток. Преимуществом консорциума штаммов микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты. Это позволяет использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтью, нефтепродуктами и остаточной замазученностью.

Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Acromonas species ВКМ В-2047Д, Acromonas species ВКМ В-2048Д, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2049Д, Alcaligenes denitrificans ВКМ В - 2050 Д, Arthrobacter species ВКМ В - 2051Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.