ШТАММ БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N1/00 C02F3/28 

Изобретение относится к промышленной индустриальной и экологической микробиологии, биотехнологии очистки промышленных стоков, прежде всего содержащих растворенные металлы: металлургических, гальванических, шахтных вод, стоков месторождений и т.п.

Известно применение сульфатредуцирующих бактерий для очистки вод от растворенных металлов за счет связывания их в нерастворимые сульфиды образованным бактериями сероводородом. Этот процесс показан для сурьмы, висмута, кадмия, кобальта, никеля, свинца, железа, цинка (Miller L.P. - Formation of metal sulfides through the activites of sulfatereducing bacteria - Contrib. Boyce Thompson Inst., 1950, v.16, N 3, p.85), серебра, олова и ряда других металлов (Вaas-Becking L.G., Moore D. - "Biogenic sulfides" - Econ. Biol., 1961, v.56, p.259). Использование сульфатредуцирующих бактерий для очистки сульфатсодержащих сточных промышленных вод от растворенных металлов описано для производств и защищено авт. св. (Губин В.Е., Смирнов Ю.Г., Смирнова Г. Ф., Горелов В.С., Максимова Н.И., Баглай С.В., Зайнуллин Х.Н. - "Биохимическая очистка сульфатсодержащих сточных воды" - Химия и технология воды, 1984, т. 6, N 5, с.465; БИ СССР, 1981, N 31, авт.св. 857013 "Способ биохимической очистки сточных вод от ионов металлов"; 1982, N 18, авт.св. 927759 "Способ биохимической очистки сточных вод от сульфатов и ионов металлов").

В промышленном применении сульфатредуцирующих бактерий работы ведутся, как правило, без описания конкретных использованных штаммов. Вместе с тем известные характеристики сульфатредуцирующих бактерий, данные по их распространению и отношению к высоким концентрациям растворенных металлов (в первую очередь - железу) позволяют установить наиболее успешно применявшийся до сих пор микроорганизм-прототип. Наиболее близким по сущности, применимости и достигаемому эффекту к предлагаемому штамму является штамм Desulfovibrio desulfuricans NCIB 8307 (Национальная коллекция индустриальных бактерий, Великобритания), выделенный из образованного им сульфида железа на поверхности металлической трубы газопровода ("The National Collektion of Industrial Bacteria. Catalogue of strains", Aberdeen, The University Press, 1986, p.47).

Недостатком штамма-прототипа является необходимость наличия в среде, обеспечивающей его рост, органических соединений (The National Collection of Industrial Bacteria. Catalogue of strains., Aberdeen. The University Press, 1986, p.100). Этот же недостаток для осаждения растворенных металлов биогенным сероводородом, т.е. потребность во внесении в среду органических субстратов, подтверждается в литературе для всех аналогов - других штаммов сульфатредуцирующих бактерий (Каравайко Г.И., Кузнецов С.И., Голомзик А.И. - "Роль микроорганизмов в выщелачивании металлов из руд", М., "Наука", 1972, с.8-12; Postgate J.R. - "The sulphate-reducing bacteria", Cambridge, University Press, 1981, p.111-112). В лабораторных условиях для обеспечения образования сероводорода вносят в среды отдельные органические субстраты известного состава: лактат, пируват, дрожжевой экстракт и т.п. (The National Collection of Ingustrial Bacteria. Catalogue of strains, Aberdeen, The University Press, 1986, p.100; Каравайко Г.И., Кузнецов С.И., Голомзик А.И. - Роль микроорганизмов в выщелачивании металлов из руд, М.: Наука, 1972, с. 215-216; Postgate J. R. - The sulphate-reducing bacteria, Cambridge, University Press, 1981, p.26-27) или в производственных условиях дешевые органические субстраты с неизвестным конкретным химическим составом, например: древесные опилки (Tuttle J.H., Dugan P.R., Macmillan C.B., Randles C.J. - Microbial dissimilatory sulfur cycle in acid mine water, J.Bacteriol, 1969, v. 97, N 2, p. 594) или бытовые сточные воды, или сточные воды производств органического вещества - БВК и т.п. (БИ СССР, 1980, N 18, авт. св. 820515 Способ биохимической очистки сточных вод от сульфатов и ионов металлов).

Целью изобретения является выделение и селекция активного штамма-продуцента сульфида для очистки вод от растворенных металлов с высокой активностью в отсутствие органических субстратов.

Новый штамм D.desulfuricans УФ-1 получен путем выделения из сточных вод гальванического цеха с повышенным содержанием растворенных металлов и последующей селекции стандартными методами на элективных средах.

Полученный штамм бактерий D.desulfuricans УФ-1 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) под номером ВКМ В-1732 Д.

Штамм D.desulfuricans ВКМ В-1732 Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки размером 3-5х0,5-0,6 мкм, одиночные, вибрионы или сигмоиды. Неподвижные. Грамотрицательные.

Строгий анаэроб, использует сульфаты как акцептор электронов (сульфатное дыхание). Восстанавливает сульфаты до сульфида. В отсутствие сульфата сбраживает пируват.

Доноpы водорода при сульфатредукции: лактат, пируват, этанол, формиат. Лактат, пируват и этанол окисляются при этом с образованием ацетата.

Источники углерода при сульфатредукции: лактат, пируват, этанол, формиат, ацетат, карбонат (бикарбонат). В присутствии донора водорода ацетат или карбонат могут служить единственными источниками углерода. Способен к автотрофному росту.

Оптимальная температура: 30-35^оС, оптимальная величина pH 7,0-7,4.

Штамм D.desulfuricans ВКМ В-1732 Д идентифицирован по определителю Берги ("Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", v.1, 9 ed., Baltimore, William & Wilkins, 1984). Отличается от штамма-прототипа неподвижностью и способностью к автотрофному росту.

П р и м е р 1. Активность штамма при автотрофном росте в лабораторных условиях.

Посевной материал получают выращиванием штамма во флаконах в виде суспензии и осадка на среде следующего состава, г/л: K₂HPO₄-0,5; NH₄Cl-1,0; Na₂SO₄-1,0; CaCl₂x2H₂O-0,1; MgSO₄x2H₂O-2,0; лактат-2,0; дрожжевой экстракт
- 1,0; FeSO₄x7H₂O-0,5; NaHCO₃-3,0; Na₂Sx9H₂O-0,15; дистиллиро- ванная вода - 1 л; pH среды 7,0-7,4, температура культивирования 30-35^оС. Рост происходит в анаэробных условиях в течение 48 ч.

Полученную биомассу отделяют от среды центрифугированием в течение 0,5 ч при 16 тыс.об./мин., отмывают физиологическим раствором и засевают в среду сходного состава, но не содержащую лактат и дрожжевой экстракт. Культивирование проводят в тех же условиях, скорость образования сероводорода в отсутствие органического вещества составляет 5,0 мг H₂S/миллиард клеток в 1 ч.

Для сравнения следует указать, что скорость образования сульфида в присутствии органических субстратов (лактата и дрожжевого экстракта) составляет 0,1 мг H₂S/миллиард клеток в 1 ч.

П р и м е р 2. Образование сероводорода штаммом Desulfovibrio desulfuricans ВКМ В-1732 Д при культивировании его на промышленных сточных водах Пермского электротехнического завода.

Воды содержали (мг/л): сульфат - 500; медь - 15,5; хром - 13,1; железо - 9,2; никель - 2,0; кадмий - 0,2.

Культура была внесена в концентрации 10 млн.кл./мл на носителе в биотенк. Количественный учет конечной численности клеток оказался невозможен в связи с их сорбцией на пористом носителе, полуколичественный учет подтвердил их присутствие в приблизительно прежнем количестве.

В результате образования сероводорода в течение 48 ч количество учтенных сульфидов составило 100 мг S/л, количество сульфатов - 200 мг SO₄^2-/л, медь в растворе - 0; хром - 0; железо - 0,9; никель - 0; кадмий - 0. Приведенные данные подтверждают активное образование сероводорода штаммом в сточных промышленных водах.

П р и м е р 3. Образование сероводорода штаммом Desulfovibrio fesulfuricans ВКМ В-1732 Д при культивировании его в присутствии растворенных тяжелых металлов.

Пример 2 уже являлся показателем устойчивости патентуемого микроорганизма к тяжелым металлам. Ниже приведен пример культивирования в модельном стоке с более высокими концентрациями тяжелых металлов. Состав модельного стока (мг/л): сульфат - 500; медь - 80; железо - 70; хром - 70; цинк - 27. никель - 23.

Культура была внесена в концентрации 10 млн.кл./мл на носителе в биотенк с модельными сточными водами. Количественный учет конечной численности клеток оказался невозможен в связи с их сорбцией на пористом носителе, полуколичественный учет подтвердил их присутствие в приблизительно прежнем количестве.

В результате образования сероводорода в течение 96 ч количество учтенных сульфидов составило 160 мг S/л, количество сульфатов - 40 мг SO₄^2-/л; медь в растворе - 0,10; железо - 1,5; хром - 0; цинк - 0,15; никель - 0,15. Приведенные данные подтверждают активное образование сероводорода штаммом в присутствии ионов тяжелых металлов и устойчивость к ним в условиях промышленного стока (пример 2) и при более высоких концентрациях (пример 3).

Сохранение свойств устойчивости к тяжелым металлам и способности к автотрофному росту штаммом Desulfovibrio desulfuricans ВКМ В-1732 Д.

В лабораторных условиях патентуемый штамм выращивали на среде Постгейта, не содержащей тяжелых металлов. Ежеквартально на протяжении 1990 г. этой культурой засевали промышленный сток (см. пример 2) с суммарным содержанием 40 мг тяжелых металлов в 1 л. При этом активность образования сероводорода в среде с тяжелыми металлами не уменьшалась независимо от времени ее выращивания на среде Постгейта в течение 16 мес. Эти данные свидетельствуют о сохранении штаммом свойств устойчивости к тяжелым металлам.

Автотрофный рост патентуемого штамма поддерживают в течение 16 мес периодическими пересевами на среде, не содержащей органических соединений как субстраты роста. В этих условиях штамм выдержал более 10 пассажей.

Параллельный вариант культуры, растущий в гетеротрофных условиях, был проверен на сохранность свойства автотрофии переносом в среду без органических субстратов роста и тремя последовательными пассажами в ней. При трех последовательных пассажах и соотношении инокулюма к среде 1:9 возможное вносимое при посеве органическое вещество разбавляется в 1000 раз. Автотрофный рост культуры после переноса ее из гетеротрофных условий подтвердил сохранение способности к автотрофии.

Преимущества штамма D.desulfuricans ВКМ В-1732 Д по сравнению со штаммом D. desulfuricans NCIB 8307 заключаются в способности к росту и образованию сульфида в отсутствие органических субстратах, в более высоком уровне удельной активности клеток (количестве продуцируемого сульфида на единицу белка биомассы), иными словами, в более высоком выходе целевого продукта, а также без внесения дополнительных субстратов. За период культивирования штамма в автотрофных условиях (16 мес лабораторных экспериментов) не наблюдалось случаев необходимости внесения органических компонентов или факторов роста. В условиях гетеротрофного роста прирост численности клеток патентуемого штамма выше, чем в аналогичных условиях при автотрофном росте. Указанная разница в урожае клеток не снижает промышленной значимости штамма, так как предварительное наращивание биомассы штамма проводят в гетеротрофных условиях, а уже затем ее помещают в биотенк для активной продукции сероводорода в условиях ограниченного углеродного питания. Кроме того, штамм D.desulfuricans ВКМ В-1732 Д характеризуется более высокой устойчивостью к присутствию растворенного железа по сравнению со штаммом-прототипом, что расширяет возможности его использования для очистки сточных вод производственных предприятий.

Таким образом, штамм D.desulfuricans ВКМ В-1732 Д не только превосходит известные применяемые для осаждения металлов продуценты сульфида по отсутствию потребности в органических субстратах, но и является более технологичным по своим свойствам.

Использование: горнодобывающая промышленность, очистка сточных вод. Сущность изобретения: из сточных вод гальванического цеха выделен штамм Desulfovibrio desulfuricans ВКМ В-1732Д, обладающий повышенной устойчивостью к ионам тяжелых металлов. Отличается от типового штамма способностью к автотрофному росту. Оптимальная температура культивирования 30-35°С, оптимальное значение pH 7,0-7,4.

Штамм бактерий Desulfovibrio desulfuricans ВКМ В-1732 Д - продуцент сульфида, используемый для очистки промышленных сточных вод от ионов тяжелых металлов.