СПОСОБ АНАЛИЗА ПОПУЛЯЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1994 года по МПК C12N5/02 C12N5/00 

Изобретение относится к биологии, в частности к биологии клетки в культуре, и может быть использовано для изучения клеточных основ (естественного и индуцированного) старения.

Фибробласты являются главным клеточным элементом соединительной ткани в организме. Кроме того, фибробласты, составляя строму многих органов, являются важными участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения, необходимые для дифференцировки и функционирования других специализированных клеток. Популяция нормальных фибробластов человека включает две субпопуляции клеток. Одни фибробласты обладают высоким пролифеpативным потенциалом и при клонировании образуют мнгогоклеточные колонии (I тип), а другие имеют низкий митотический потенциал и в клональных условиях дают малоклеточные, рыхлые колонии (II тип). Морфологически первые представляют собой веретеновидные клетки, а вторые - парусовидные и плейоморфные клетки. Фибробласты I типа дифференцируются в фибробласты типа II. С возрастом донора и при старении культур фибробластов накапливаются клетки с пониженным пролиферативным потенциалом (парусовидные и плейоморфные).

Наиболее близким к данному изобретению является способ анализа популяции фибробластов, при котором используется методика получения индивидуальных клеточных клонов.

Способ заключается в следующем.

1. Суспензию одиночных клеток вносят в чашки Петри для получения индивидуальных клонов.

2. Соотношение отличающихся морфологией клеток колоний определяют на 14-18-е сутки после посева.

Недостатками способа являются:
1. При низкой эффективности клонирования полученные клоны не всегда отражают состав анализируемой популяции в целом.

2. Из клетки I типа может возникнуть клон II типа, что обусловлено дифференцировкой на ранних этапах формирования клона.

3. Плейоморфные клетки (отростчатые) вообще не образуют клонов, поэтому их доля в исходной популяции не может быть выявлена при получении клонов. Кроме того, способ является трудоемким и длительным, требует наличия специальных компонентов среды (в частности, дорогостоящей пуповинной сыворотки человека).

Целью изобретения является разработка более точного, дешевого и простого способа, а также сокращение сроков анализа популяции фибробластов.

Цель достигается тем, что анализ популяции фибробластов осуществляется с помощью определения соотношения клеток I и II типов сразу после их прикрепления к субстрату.

Сущность способа состоит в том, что фибробласты человека, полученные из кожно-мышечной ткани 7-8-недельных эмбрионов человека, культивируют в среде Игла, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота. В логарифмической фазе роста проводят трипсинизацию клеток с помощью 0,02% раствора Версена и 0,25% раствора трипсина при 4^оС (2 мин) с последующей инкубацией в термостате при 37^оС (до 10 мин).

На чашки Петри (диаметром 35 мм) высевают клетки в концентрации 500-100 кл/мм². Чашки Петри с клетками инкубируют в условиях насыщающей влажности при 37^оС с 5% CO₂. Через 20-24 ч после посева клетки фиксируют и окрашивают. Для окрашивания используют 2%-ный раствор орсеина в 45%-ной уксусной кислоте. Цитоморфологический анализ структуры популяции фибробластов по соотношению двух типов клеток проводят под микроскопом.

На фиг. 1 показано изменение доли (в %) веретеновидных, парусовидных и плейоморфных клеток в популяции фибробластов человека в процессе стационарного старения (цитоморфологический анализ редкого монослоя после перевода клеток на бессывороточную среду).

Структура популяции фибробластов человека:
А - веретеновидные клетки
Б - парусовидные клетки
В - плейоморфные клетки
1 - исходная популяция клеток
2 - популяция клеток через 3 сут после посева
3 - популяция клеток через 7 сут после посева
4 - популяция клеток через 10 сут после посева
5 - популяция клеток через 20 сут после посева.

На фиг. 2 дано изменение доли в (в %) веретеновидных, парусовидных и плейоморфных клеток в популяции фибробластов человека при радиационном старении (цитоморфологический анализ редкого монослоя после воздействия радиации в дозе 2 Гр).

Структура популяции фибробластов человека:
А - веретеновидные клетки
Б - парусовидные клетки
В - плейоморфные клетки
1 - исходная популяция клеток
2 - популяция клеток через 3 сут после посева
3 - популяция клеток через 7 сут после посева
4 - популяция клеток через 10 сут после посева
5 - популяция клеток через 20 сут после посева
П р и м е р. Фибробласты человека, полученные из кожно-мышечной ткани 7-8-недельных эмбрионов человека (Штаммовая культура, 7 пассаж) высевают в сосуды Карреля в концентрации 2-3х10⁵ кл. в мл. Для культивирования используют среду Игла с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота.

Стационарные культуры эмбриональных фибробластов человека получают переводом клеток (смена ростовой среды) на бессывороточную среду. В ходе стационарного старения, через 3, 7, 10 и 20 сут, клетки трипсинизируют с помощью 0,02%-ного раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина при 4^оС (2 мин) с последующим помещением в термостат при 37^оС (до 10 мин).

Концентрацию клеток в суспензии оценивают в камере Горяева. На чашки Петри (диаметром 35 мм) высевают клетки в концентрации 500-1000 клеток на см². Чашки с клетками инкубируют в условиях насыщающей влажности при 37^оС с 5% CO₂. Через 20-24 ч клетки фиксируют и окрашивают 2%-ным раствором орсеина в 45%-ной уксусной кислоте.

В экспериментах по радиационному старению опытную монослойную культуру фибробластов (7 пассаж) в логарифмической стадии роста облучают гамма-лучами (¹²³Cs) в дозе 2Гр на установке ЛМБ- γ -1 м при мощности дозы 40 Р/мин. После облучения через определенные промежутки времени (3, 7, 10 и 20 сут) клетки трипсинизируют и готовят препараты с редкими монослоями вышеизложенным способом.

Цитоморфологический анализ структуры популяции фибробластов по соотношению веретеновидных, парусовидных и плейоморфных клеток проводят с помощью микроскопа (МБИ-9), используя специальную сетку размером 8х8 мм, с ценой деления стороны квадрата 0,5х0,5 мм, которая устанавливается в окуляр микроскопа. Анализируют 10 полей зрения, выбранных непроизвольно по ходу часовой стрелки. На каждую точку ставят по 5 повторностей (чашек Петри).

Показано, что как при стационарном, так и при радиационном старении происходит постепенное, особенно резко выраженное в последний срок (20 сут), уменьшение доли веретеновидных клеток.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что причиной естественного и индуцированного радиацией старения клеточных популяций является накопление малоактивных клеток (II тип).

Использование: медицина, иммунология, биотехнология. Сущность изобретения: фибробласты человека, полученные из кожно-мышечной ткани эмбрионов, подвергают трипсинизации. Затем высевают клетки на чашки Петри и инкубируют в питательной среде в течение 20 - 24 ч. Клетки фиксируют и окрашивают, цитоморфологический анализ популяции фибробластов проводят путем микроскопирования, подсчитывая при этом соотношение веретеновидных, парусовидных и плейоморфных клеток. 2 ил.

СПОСОБ АНАЛИЗА ПОПУЛЯЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА, включающий трипсинизацию клеток, посев и - инкубацию в питательной среде с последующим подсчетом веретеновидных, парусовидных и плейоморфных клеток, отличающийся тем, что посевная доза составляет 500 - 1000 клеток / см², время инкубации 20 - 24 ч, а подсчет клеток проводят путем микроскопирования.