Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12N7/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии и может быть использовано для культивирования вируса лейкоза крупною рогатого скота (КРС) и накопления вирусной биомассы для приготовления иммунодиагностиче- ских и иммунопрофилактических средств, а также при исследовании биологии вируса лейкоза КРС, в том числе и для сравнительного анализа антигенных свойств ретрови- русов.

Цель изобретения - получение нового штамма клеток, используемого для культивирования вируса лейкоза КРС. позволяющего получить целевой продукт с большей иммунобиологической активностью, т е видовой антигенной гомогенностью

Штамм получают следующим образом Почку двухмесячного эмбриона коровы с соблюдением условий асептики помещают на стерильную чашку Петри, измельчают ножницами на кусочки 1-3 мм и проводят щадящую трипсинизацию. Далее клетки ре- суспендируют в среде Игла с 10%-ной сывороткой КРС и культивируют в матрасах с концентрацией клеток 5-8 х 104 в 1 мл при 37°С. Первый пассаж после формирования

О СЛ

го со со

00

монослоя в первичной культуре проводят на 7 сут, а последующие - 1 раз в неделю.

Донорами вируса лейкоза КРС при перманентном инфицировании акцепторных клеток первичной культуры служат клетки линии FLK, культивируемые стационарно в виде монослоя с использованием указанной ростовой среды.

Трансмиссию генома вируса лейкоза КРС проводят при культивации первичной культуры клеток почки эмбриона коровы на 3-м пассаже с летально облученными (3000 рад) клетками линии FLK.

Полученный штамм, обладающий морфологической и культуральной стабильно- стью, обозначен Mi 18. Штамм Ml 18 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзный коллекции клеточных культур под номером ВСКК (П)2990 и харак- теризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Фибробластоподобные веретенообразные и полигональные клетки, связанные одна с другой отростками, имеют четко выраженные границы, прозрачную цитоплазму. Цитоплазма и ядро ориентированы по длине оси клеток. В центре клетки имеется крупное ядро овальной формы с 2-4 ядрышками. При формировании плотного моио- слоя встречаются очаги многослойности. В цитоплазме и ядре специфичных включений не наблюдается. Митотический индекс а пределах 17-20%.

Физиологические признаки.

Клетки в стационарной культуре расгуг в виде монослоя в ростовой среде Игла с глютамином или на смеси сред Игла и 199 (1:1) с добавлением 10%-ной инактивиро- ванной сыворотки КРС и антибиотиков в обычной дозировке. Оптимальная плотность посева 3-5 х 104 клеток в 1 мл. Клетки обладают хорошей адгезивностью. Плотный монослой формируется йа 5-6 сут культивирования. При пересеве культуры дезинтеграция монослоя производится 3-5- минутной обработкой клеток подогретой до 37°С с смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора Версена (1:1). Коэффициент пересева клеток 1:3-1:4, пересев производится 1-2 раза в неделю.

Кариологическое исследование клеток линии Ml 18, проведенное на 73 пассаже, показало, что размах изменчивости по числу хромосом в клетках в популяции широкий (35-153), ярко выраженная анэуплоидия. Полиплоидные клетки составляют 82,6%, число хромосом в модальном классе 60-72, клетки данного класса составляют 35,4%.

Эффективность клонирования клеток Mi 18 в питательной среде Игла с добавлением инактивированной сыворотки эмбриона коровы составляет 85-90%.

Иммунологический анализ антигенов клеток Mi 18 показал, что в реакции иммунной диффузии (РИД) экстракт клеток реагирует с кроличьей иммунной сывороткой против белков сыворотки крови КРС, Иммунная сыворотка против клеток Mi 18 положительно реагирует в РИД с экстрактом почки эмбриона коровы, а также с белками сыворотки КРС.

При пассировании культуры после 25 пассажей при определении ревертазной активности вирусной фракции культуральной жидкости 7-суточной культуры Mi 18 по методу Ложа и др. обнаружена высокая вирус- продуцирующая активность, достигающая 10 -10 вирусных частиц в 1 мл.

Вирус лейкоза КРС и его антигены, выделенные клетками Mi 18 в культуральную жидкость, выявляются также с помощью РИД в агаровом геле в варианте для определения титра антигена.

Наличие экстрацеллюлярного вируса лейкоза КРС и его антигенов в культуральной жидкости клеток Mi 18 регистрируют также при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). После осветления культуральной жидкости (5000 об/мин, 30 мин) вирус лейкоза КРС осаждают в 20%-ном градиенте плоскости сахарозы ультрацентрифугированием, лизируют, иммобилизи- руют на полистироловых панелях, инкубируют с антителами против вируса лейкоза КРС и выявляют при помощи вторичных антител меченных пероксидазой.

Интрацеллюлярный вирус лейкоза КРС в клетках Ml 18 выявляют при помощи твердофазного ИФА в варианте CELISA, когда в качестве тестируемого антигена используют иммобилизированные на дне лунок полистироловых планшет монослойнофик- сированные и пермаабилизированные клетки.

При обследовании клеток штамма Ml 18 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм ) получают отрицательные результаты.

При обследовании клеток штамма Mi 18 в опытах на взрослых и новорожденных белых мышах, кроликах патогенных агентов не выявляют.

Криоконсервация.

Для криоконсервации применяют среду Игла с добавлением глютамина и 10%-ной сыворотки КРС. В качестве криопротектора используют 10-ный диметилсульфоксид при концентрации клеток 2-3 х 10 мл. Жизнеспособными после восстановления остаются 80-85% клеток.

Пример1.В стерильные 1,5-литровые матрасы заливают по 150 мл суспензии клеток Mi 18 в ростовой среде (3-5 х 104 кл/мл), состоящей из смеси сред Игла и 199 (1:1) с добавлением 10%-ной сыворотки КРС и антибиотиков в общепринятой дозе. Матрасы герметически закрывают резиновыми пробками и инкубируют при 37°С. Суспензию вируспродуцирующих клеток для инокуляции готовят при помощи дезинтеграции мо- нослойнорастущей культуры, обрабатывая ее подогретой до 37°С смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора Версена (1:1). После 2-5-минутного воздействия дезинтегратор с монослоя сливают и клетки заливают питательной средой. При потряхивании клетки переходят в суспензионное состояние. Число клеток в суспензии подсчитывают в камере Горяева. Когда рассеянные клетки в матрасах через 6-7 сут формируют сплошной монослой и среда приобретает желтоватый оттенок, производят сбор культуральной жидкости с вирусным материалом с монослоя. Монослой вируспродуцирующих клеток дезинтегрируют и рассеивают в новые матрасы, кратность рассева 1:3, 1:4.

Собранную культуральную жидкость осветляют при 5000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Затем надосадочную жидкость собирают в обработанные детенгентом диализные мешки. На 50 мл культуральной жидкости берут 10 г 6000 М полиэтиленгли- коля (ПЭГ)и ПРИ его воздействии собранный материал концентрируют при комнатной температуре 24 ч. Зачтем концентрат из диализных мешков вынимают, добавляют 0,1 мл 10%-ного тритона Х-100 на 1 мл концентрата и оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Полученный антиген, разведенный физиологическим раствором (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16). тестируют в РИД в агаре, используя положительную сыворотку против вируса лейкоза КРС и отрицательную сыворотку. Титром антигена считают последнее разведение, дающее преципитат с положительной сывороткой (1:2; 1:4). ИЗ 1 л культуральной жидкости получают до 1000 доз диагностикума, который можно использовать в качестве тест-антигена в серологических иммунодиагностических реакциях с целью выявления антител к вирусу лейкоза КРС в сыворотке крови инфицированных животных или других биологических жидкостях.

П р и м е р 2. Вируспродуцирующие клетки Mi 18 культивируют стационарно по примеру i. Собранную культуральную жидкость с вирусным материалом осветляют

при 5000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Затем вирус осаждают в 20%-ном градиенте плотности сахарозы ультрацентрифугированием при 28000 об/мин в течение 2 ч. Вирусный осадок ресуспендируют а 5 мл

ТНЭ буфера (0.01 М трис-HCI, 0,1 М NaCI. 0,001 М N32 ЭДТА, рН 7,4) с 15%-ной саха розой. Слой вирусной суспензии наносят на линейный 25-60%-ный градиент плотности сахарозы в буфере ТНЭ и ультрацентрифугируют в течение 2.5 ч при 32000 об/мин при 4°С. При помощи микронасоса собирают отдельные фракции, определяют ревертазную активность, диализируют и хранят при - 70°С. Для ИФА используют полистироловые панели отечественного производства с плоскодонными 96-ю лунками, активированные УФ-облучением. Их покрывают вирусным препаратом (100 мкл на лунку) и иммобилизацию антигена проводят при помощи инкубации в течение ночи при 4°С. Неадсорбированный белок удаляют, промывают забуференным фосфатным раствором (ЗФР) и проводят блокирование 1%-ным раствором человеческого альбумина в течение 1 ч при 37°С. после чего лунки опять промывают ЗФР. Далее проводят инкубацию с исследуемыми сыворотками крови КРС (100 мкл на лунку), разведенными 1:10, 1:50 и 1:100. Контролем служат отрицательные и положительные сыворотки против вируса лейкоза КРС из диагностического набора Курской биофабрики. После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промывают ЗФР и вносят вторичные антитела - антисыворотку к иммуноглобулинам КРС, меченную пероксидазой в рабочем разведении по 100 мкл, и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После промывания ЗФР добавляют субстрат (ОФД-Н202, и продукты ферментативной реакции определяют спектрофотометрически. Положительная реакция ИФА на наличие антител к вирусу лейкоза КРС у инфицированных животных регистрируется по вычислению относительной величины (0В) оптических плотностей тестируемой и отрицательной контрольной сывороток. При положительной реакции ИФА 0В выше 2.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы BCKK(II) 299D для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии и может быть использовано для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) Цель изобретения - получение нового штамма клеток, используемого для культивирования вируса лейкоза КРС и позволяющего получить целевой продукт с большей иммунобиологической активностью (видовой антигенной гомогенностью) Штамм клеток почки эмбриона коровы Mi 18 ВСКК(П) 2.99D обладает большей по сравнению с известным перевиваемым штаммом клеток FLK видовой антигенной гомогенностью Культивируется на доступных питательных средах и сыворотках отечественного производства Пригоден для культивирования и накопления вирусной биомассы с целью приготовления иммуно- диагностических и иммунопрофилактических средств, а также при исследовании биологии вируса лейкоза КРС, в том числе для сравнительного анализа антигенных свойств ретровирус в Ё