СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИКА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ Российский патент 1994 года по МПК A61K35/66 C12N1/20 

Изобретение относится к молочной, биотехнологической промышленности и предназначено для непосредственного использования или в качестве добавки в корм телятам, поросятам, ягнятам, птице, пушным зверям, а также домашним и лабораторным животным с целью быстрейшего формирования нормального микробиоценоза кишечника, а также профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Известен способ производства сухого бактериального препарата (СБА), содержащего Laadophilus, B. bifidum, Str. faecium, предназначенного для лечения желудочно-кишечных заболеваний животных. Такой препарат получают путем распылительной сушки смеси указанных культур, причем каждая культура выращивается отдельно на молоке.

Недостатком способа является использование в составе микрофлоры препарата фекального стрептококка Str. faecium, который является условно-патогенным, относится к санитарно-показательным микроорганизмам и поэтому не пригоден для применения на предприятиях молочной промышленности.

Кроме того, в состав препарата включены бифидобактерии вида B.bifidum, которые не характерны для микробиоценоза кишечника животных, а также неспецифические для животных штаммы ацидофильной палочки. Концентрация бифидобактерий в препарате такова, что одна лечебная доза бифидобактерий обеспечивается дачей около 100 г препарата.

Данный вид бифидобактерий B. bifidum преобладает в кишечнике грудных детей. Недостатком способа является также приготовление закваски из чистой культуры бифидобактерий. Такой прием приготовления закваски трудно осуществить на промышленных предприятиях из-за медленного размножения бифидобактерий в молоке и др. питательных средах.

Сущность изобретения заключается в изменении состава питательной среды, применяемой для промышленного выращивания бифидобактерий за счет дополнительного введения ацетата натрия, гидрофосфата или дигидрофосфата калия двухводного, использования в качестве энергетического источника глюкозы вместо лактозы, а также повышения концентрации кукурузного экстракта до 1,0-2,0 мас.%, сернокислого закисного железа до 0,03-0,05 мас.% и снижения содержания трехзамещенного лимоннокислого натрия до 0,4-0,5 мас.%, в изменении состава микрофлоры, соотношения культур и способа накопления их биомассы, предусматривающего совместное выращивание бифидобактерий вида B.thermophilum с мезофильными молочнокислыми стрептококками L. lactis subsp. diacetilactis на питательной среде при посевных дозах 8-10 мас.% и 0,01-0,1 мас. % соответственно, и отдельное выращивание ацидофильной палочки на молоке; использовании в качестве легкоусвояемого кормового субстрата и одновременно среды высушивания белкового гидролизата обезжиренного молока, полученного с помощью протосубтилина активностью 70-80 ед./г в течение 6-8 ч гидролиза при дозе фермента 0,020-0,080 мас.%; внесении в сгущенный белковый гидролизат 5-20% инокулянта, содержащего бифидобактерии и молочнокислые стрептококки, и 15% закваски ацидофильной палочки; распылительной сушке смеси.

Предусматривается также применение центробежного отделения биомассы бифидобактерий и молочнокислых стрептококков от культуральной среды перед ее внесением в сгущенный белковый гидролизат, позволяющий увеличить в 5-10 раз количество бифидобактерий в готовом продукте.

Существенным отличительным признаком изобретения является использование в качестве микрофлоры кормовой добавки штаммов бифидобактерий, выделенных от животных вида Bihdobacterium thermophilum.

В состав питательной среды вводят следующие компоненты, мас.%: Глюкоза 0,4-0,5 Кукурузный экстракт 1,8-2,0 Цитрат натрия трехзамещенный 0,4-0,5 Ацетат натрия 0,2-0,3 Калия гидрофосфат или дигидрофосфат двухводный 0,1-0,2 Железо сернокислое закисное семиводное 300-500 мг/л;
(0,03-0,05); Агар - агар 700-750 мг/л
(0,07-0,075);
Основа - частично гидролизованное протосубтилином 3%-ное обезжиренное молоко.

Накопление штаммов бифидобактерий, выделенных от животных, производят с мезофильными молочнокислыми стрептококками при температуре 39-41^оС при посевных дозах культур 8-10 мас.% и 0,1-0,01 мас.% соответственно. Штаммы ацидофильной палочки, выделенные от животных, выращивают в обезжиренном молоке.

Молоко, предназначенное для приготовления белкового гидролизата, нагревают до температуры 55-57^оС и вносят протосубтилин в количестве 0,02-0,08 мас.%. Гидролиз ведут при указанной температуре 6-8 ч при постоянном перемешивании. По окончании гидролизат подвергают термической обработке при температуре 90^оС в течение 25-30 мин. Далее гидролизат сгущают в вакуум-выпарной установке при температуре 60-65^оС до массовой доли сухих веществ 35-42% . При температуре 45-50^оС в гидролизат вносят 5-20% инокулянта совместной культуры бифидобактерий и молочнокислых стрептококков (или их биомассы, полученной после сепарирования культуральной среды) и 1-5% закваски ацидофильной палочки, после чего смесь подвергают распылительной сушке.

Сухой прибиотический продукт, полученный по описанному выше способу, содержит в 1 г сотни миллионов жизнеспособных клеток бифидобактерий и десятки-сотни миллионов клеток ацидофильной палочки; содержание аминного азота в продукте составляет 0,1-0,12 мас.%.

Полученный препарат фасуют и упаковывают.

П р и м е р 1. В 1000 л водопроводной воды вносят 30 кг сухого обезжиренного молока, после тщательного перемешивания, смесь нагревают до 55^оС, доводят рН с помощью раствора NaОН до 6,75, добавляют 150 г протосубтилина Г 10х активностью 70 ед/г и выдерживают при этих условиях 2,5 ч. После гидролиза в среду вносят 0,5 кг глюкозы, 0,5 кг треxзамещенного цитрата натрия, 1,8 л кукурузного экстракта, 0,3 кг уксуснокислого натрия, 0,2 кг гидрофосфата калия двухводного, 0,03 кг сернокислого железа 7-водного, 0,07 кг агар-агар. Среду стерилизуют при 121^оС в течение 15 мин, затем охлаждают до 40^оС, после чего инокулируют 10% культуры B.thermophilum Y-3, выделенного от телят, и 0,01% культуры L. lactis subsp. diacetilactis 506₁. Выращивание микроорганизмов проводят при 40^оС в течение 16 ч. Затем выращенной смесью культуp инокулируют новую порцию среды в количестве 10%. Выращивание пересадочной совместной культуры проводят при температуре 40^оС в течение 15 ч.

В обезжиренном молоке при температуре 37^оС выращивают чистую культуру ацидофильной палочки (штамм ВКПМ В - 2728), выделен от телят, в течение 14 ч до образования сгустка.

Обезжиренное молоко кислотностью 18^оТ, полученное сепарированием молока, отвечающего требованиям ГОСТ 13264-70, в количестве 100 кг подают в ферментер с мешалкой, подогревают до температуры 57^оС, раствором NaOH доводят рН до значения 6,75 и при постоянном перемешивании вносят 0,3 мас.% препарата протосубтилина Г10х активностью 80 ед./г. Гидролиз ведут при температуре 57^оС в течение 6 ч при постоянном перемешивании. Через 6 ч гидролизат сгущают в вакуум-выпарной установке до содержания суxиx веществ 35% .

В сгущенный до содержания 35% сухих веществ белковый гидролизат обезжиренного молока при температуре 45^оС вносят 10% совместной культуры бифидобактерий и молочнокислых стрептококков и 1% культуры ацидофильной палочки. После тщательного перемешивания смесь подвергают распылительному высушиванию.

Готовое сухое кормовое средство для телят с содержанием аминного азота 0,1% содержит в 1 г 500 млн.к.е. бифидобактерий и 250 млн клеток ацидофильной палочки. Продукт фасуется по 10-15 г. Может применяться и другим видам животных и птице.

П р и м е р 2. В 100 л гидролизованного протосубтилином восстановленного до содержания сухих веществ 3% обезжиренного молока при температуре 57^оС и рН 6,70 добавляют 0,150 г протосубтилина и выдерживают при этих условиях 2,5 ч. Затем в частично гидролизованное молоко добавляют 0,5 кг глюкозы, 0,4 кг цитрата натрия, 2,0 л кукурузного экстракта, 0,25 кг уксуснокислого натрия, 0,15 кг дигидрофосфата двухводного, 0,05 кг сернокислого железа семиводного, 0,07 кг агар-агар. После стерилизации при температуре 41^оС среду инокулируют 10% культуры B. thermophilum B-1, выделенного от поросят, и 0,05% культуры L. lactis subsp. diacetilactis 500₆. Выращивание культур осуществляют при 41^оС в течение 15 ч. Выращенной смесью культур инокулируют в количестве 10% новую порцию питательной среды. Выращивание пересадочной совместной культуры осуществляют при 41^оС в течение 14 ч.

В обезжиренном молоке при температуре 37^оС проводят выращивание культуры L. acidophilum 3 е (выделен от телят) до момента образования сгустка.

Обезжиренное молоко кислотностью 18^оТ в количестве 100 кг подают в ферментер и подогревают до температуры 55^оС вносят и проводят гидролиз в течение 8 ч при постоянном перемешивании реакционной смеси. Через 8 ч фермент разрушают нагреванием смеси при температуре 90^оС в течение 30 мин. Готовый гидролизат сгущают в вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 42% . В сгущенный белковый гидролизат молока при температуре 45^оС вносят 15% совместной культуры бифидобактерий и молочнокислых стрептококков и 5% культуры ацидофильной палочки. После перемешивания смесь подвергают распылительному высушиванию.

Готовое пробиотическое средство для поросят с содержанием аминного азота 0,120% содержит в 1 г 350 млн. кое бифидобактерий и 600 млн. клеток ацидофильной палочки. Может применяться другим видам животных и птице. Продукт фасуется по 1-5 г.

П р и м е р 3. В приготовленную, как описано выше, питательную среду при температуре 39^оС вносят 10% культуры B. thermophilum Я-1, выделенной от ягнят, и 0,1% культуры L. lactis subsp. diacetilactis 385. Культуры выращивают при температуре 39^оС в течение 14 ч.

В обезжиренном молоке при температуре 37^оС проводят выращивание ацидофильной палочки (20Т - выделен от телят) до момента образования сгустка.

В сгущенную смесь белкового гидролизата, полученного как в примере 2, вносят 20% совместной культуры бифидобактерий и молочнокислых стрептококков и 3% культуры ацидофильной палочки. После тщательного перемешивания смесь подвергают распылительному высушиванию.

В 1 г пробиотического средства для ягнят содержится 700 млн кое бифидобактерий и 250 млн клеток ацидофильной палочки и 0,1% аминного азота. Продукт фасуется по 5-10 г. Может применяться другими видами животных, а также птице.

П р и м е р 4. В приготовленную питательную среду при температуре 40^оС вносят 10% культуры B.tpermophilum Y-2 (выделен от телят) и 0,03% культуры L.lactis subsp. diacetilactis 512₂. Культуры выращивают совместно при температуре 40^оС в течение 16 ч. После готовности их используют в качестве инокулята свежей порции питательной среды в количестве 10%. Выращивание вновь осуществляют при 40^оС в течение 14 ч.

В конце роста культуральную среду подвергают центрифугированию, а полученную биомассу вносят в сгущенную смесь.

Культуру ацидофильной палочки (штамм ВКПМ В-2728) выращивают при температуре 37^оС на стерильном обезжиренном молоке до образования сгустка.

В сгущенный белковый гидролизат обезжиренного молока, полученный, как в примере 2, при температуре 45^оС вносят 10% биомассы совместной со стрептококками культуры бифидобактерий и 5% закваски ацидофильной палочки. После тщательного перемешивания смесь подвергают распылительному высушиванию.

В 1 г пробиотического средства для телят содержатся 5 млрд. кое бифидобактерий и 90 млн клеток ацидофильной палочки и 0,110% аминного азота. Продукт фасуется по 1-10 г. Может применяться другим видам животных, а также птице.

П р и м е р 5. В приготовленную питательную среду при температуре 41^оС вносят 10% культуры B.thermophilum Y-5 (выделен от телят) и 0,08% культуры L. lactis subsp. diacetilactis 592₃. Смесь культур выращивают при 41^оС в течение 15 ч. По готовности их используют в качестве инокулята новой порции питательной среды. Производственную совместную культуру выращивают при 41^оС в течение 15 ч.

Культуру ацидофильной палочки (штамм ВКПМ, В-2728) выращивают на стерильном обезжиренном молоке при температуре 37^оС.

В сгущенный белковый гидролизат молока, полученный по примеру 2, вносят 10% производственной культуры бифидобактерий и мезофильных молочнокислых стрептококков и 4% культуры ацидофильной палочки. После тщательного перемешивания смесь подвергают распылительному высушиванию.

В 1 г пробиотического средства для телят содержится 350 млк кое бифидобактерий и 600 клеток ацидофильной палочки и 0,12% аминного азота. Продукт фасуется по 10-15 г, может применяться другим видам животных, а также птице.

Использование: в биотехнологии. Сущность изобретения заключается в изменении состава микрофлоры, соотношения культур и способа накопления их биомассы, использовании в качестве кормового субстрата и среды высушивания одновременно сгущенного белкового гидролизата обезжиренного молока, полученного в результате гидролиза протосубтилином активностью 70 - 80 ед. с дозой 0,020 - 0,030 мас.% в течение 6 - 8 ч. Накопление бифидобактерий проводят совместно с мезофильными молочнокислыми стрептококками Zactococcus lactis subsp diacetilactis на питательной среде при температуре 39 - 41°С и посевных дозах бифидобактерий 8 - 10 мас.% и молочнокислых стрептококков 0,01 - 0,1 мас. % . В состав питательной среды дополнительно вводят глюкозу в количестве 0,4 - 0,5 мас.%, ацетат натрия 0,2 - 0,3 мас.% и калия гидрофосфат или дигидрофосфат двухводный 0,1 - 0,2 мас. %, дозу кукурузного экстракта, цитрата натрия трехзамещенного и сернокислого закисного железа устанавливают равной 1,8 - 2,0; 0,4 - 0,5 и 0,03 - 0,05 мас.% соответственно. Инокулят бифидобактерий и молочнокислых стрептококков или клеточную биомассу после центрифугирования культуральной среды, а также полученную отдельно закваску ацидофильной палочки вносят в количестве 5 - 20 мас.% и 1 - 5 мас.% соответственно в сгущенный до содержания сухих веществ 38 - 42% белковой гидролизат молока и подвергают распылительной сушке. Способ обеспечивает повышение биологической ценности пробиотического средства и снижение его себестоимости, увеличение объема промышленного использования.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИКА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ, включающий культивирование бифидобактерий, молочнокислых стрептококков и ацидофильной палочки в питательных средах на молочной основе, отделение биомассы, внесение ее в защитную среду и распылительную сушку, отличающийся тем, что из бифидобактерий используют бактерии вида Bifidobacterium thermophilum, из молочнокислых стрептококков бактерии вида Lactococcus lactis subsp. diacetilactis, при этом культивирование бифидобактерий и молочнокислых стрептококков осуществляют совместно при 39 - 41^oС и посевных дозах 8 - 10 мас.% и 0,01 - 0,1 мас.% соответственно в питательной среде состава, мас.%:
Глюкоза 0,4 - 0,5
Кукурузный экстракт 1,8 - 2,0
Цитрат натрия трехзамещенный 0,4 - 0,5
Ацетат натрия 0,2 - 0,3
Гидрофосфат калия или дигидрофосфат калия двухводный 0,1 - 0,2
Железо сернокислое закисное семиводное 0,03 - 0,05
Агар - агар 0,070 - 0,075
Частично гидролизованное протосубтилином 3% -ное обезжиренное молоко Остальное
в защитную среду вносят смесь биомасс бифидобактерий и стрептококков и отдельно выращенную биомассу ацидофильной палочки в количестве 5 - 20 мас.% и 1 - 5 мас.% соответственно, а в качестве защитной среды используют сгущенный белковый гидролизат молока, полученный обработкой молока в течение 6 - 8 ч 0,020 - 0,030 мас.% протосубтилина с активностью 70 - 80 ед.