СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АТЕРОСКЛЕРОЗА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и может быть использовано для ранней диагностики атеросклероза.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Из венозной крови пациента получают сыворотку, из 5 мл которой выделяют эуглобулиновую фракцию путем диализа против фосфатного буфера с низкой ионной силой (0,001 М, рН 6,5). Время диализа - трое суток (первые сутки при комнатной температуре, вторые и третьи - при температуре 4^оС). Диализат центрифугируют в течение 20 мин при 1500 об/мин. Супернатант удаляют, а к трижды отмытому указанным фосфатным буфером осадку приливают 1,6 мл 0,14 М раствора NaCl в 0,001 М (рН 6,5) фосфатном буфере. Осадок ресуспензируют, а затем центрифугируют в течение 20 мин при 1500 об/мин. Супернатант удаляют, а осадок растворяют в 0,15 М фосфатном буфере (рН 9,0). Полученный белковый раствор нерастворимой в изотонических условиях при рН 6,5 субфракции сывороточных эуглобулинов подвергают фракционированию на колонке размером 50 х 2 см² с сефадексом G-200. Элюирующий раствор - фосфатный буфер 0,15 М (рН 7,2), скорость элюции 5-6 мл в час.

У больных атеросклерозом график профиля элюции нерастворимой субфракции сывороточных эуглобулинов представлен двумя пиками (см. фиг.1). Первый пик элюируется в свободном объеме колонки, а второй пик выходит сразу за свободным объемом. Наличие второго пика несвойственно здоровым лицам, у которых график профиля элюции представлен одним пиком, компоненты которого выходят в свободном объеме колонки (см. фиг.2). Следовательно, при хроматографической идентификации на сефадексе G-200 второго пика в составе нерастворимой субфракции сывороточных эуглобулинов диагностируют атеросклероз.

Таким образом, диагноз осуществляют по наличию вновь выявленной сывороточной фракции, которая обнаружена у лиц больных или впоследствие заболевших атеросклерозом.

При исследовании группы здоровых доноров указанная белковая фракция обнаружена не была, что дает основание судить о выделенной фракции как новой компоненте, являющейся одним из самых ранних маркеров инициирующего или пускового механизмов развития атеросклероза.

Точность предлагаемого метода несомненна, так как у всех лиц, находившихся впоследствие под наблюдением в течение 5 лет, был клинически зафиксирован атеросклероз. В то же самое время у ряда лиц с выявленными дислипопротеидемиями атерогенного типа и с отсутствием открытой фракции за период 5-летнего наблюдения клинических проявлений атеросклероза не обнаружено.

П р и м е р 1. Пациент М., 45 лет. Обpатился в Киевский НИИ кардиологии во время проведения эпидемиологического исследования по многофакторной профилактике ИБС у неорганизованного населения. Пациент с избыточной массой тела 105 кг, рост 175 см, курит в течение 26 лет в среднем 20 сигарет в день, ведет малоподвижный образ жизни. При исследовании показателей липидного обмена выявлена дислипопротеидемия: общий холестерин - 248 мг/дл, общие триглицериды - 162 мг/дл, ХС-ЛПВП - 42,2 мг/дл, холестериновый коэффициент атерогенности - 4,8.

Из сыворотки крови данного пациента выделяли эуглобулиновую фракцию, трижды отмывали ее фосфатным буфером 0,001 М (рН 6,5), а затем делили ее на две субфракции - легко растворимую в 0,14 М растворе хлористого натрия при рН 6,5 и нерастворимую в данных условиях. Нерастворимую в изотонических условиях при рН 6,5 субфракцию сывороточных эуглобулинов растворяли в 0,15 М фосфатном буфере при рН 9,0 и полученный белковый раствор подвергали дальнейшему фракционированию на колонке с сефадексом G-200. Элюирующий раствор - фосфатный буфер 0,15 М (рН 7,2), скорость элюции - 5-6 мл в час. График профиля элюции белков нерастворимой субфракции сывороточных эуглобулинов был представлен двумя пиками. Первый пик элюируется в свободном объеме колонки, а второй пик следует сразу за свободным объемом. Учитывая наличие факторов риска ИБС, а также диагностического критерия по заявляемому способу, пациент был взят на учет в группу диспансерного наблюдения. Назначено лечение: лечение с ограничением употребления углеводов и продуктов, богатых холестерином, расширение двигательного режима, гиполипидемические препараты (никотиновая кислота в дозе 3 г в день).

На третьем году диспансерного наблюдения, на фоне ухудшения клинического состояния больного с появлением признаков стенокардии и после проведения комплекса клинико-инструментальных исследований, в частности велоэргометрии, когда на третьей минуте при нагрузке 50 Вт появилась депрессия ST-сегмента на 2 мм в грудных отведениях и боль за грудиной, больному был выставлен диагноз: атеросклероз венечных артерий сердца, ИБС: стенокардия напряжения.

Показатели липидного обмена, в частности общий ХС и триглицериды несколько снизились, однако коэффициент атерогенности остался высоким: общий холестерин - 231,0 мг/дл, общие триглицериды - 151,4 мг/дл, ХС-ЛПВП - 40,5 мг/дл, коэффициент атерогенности - 4,7;
При повторном проведении хроматографического фракционирования нерастворимой субфpaкции сывороточных эуглобулинов на колонке с сефадексом G-200 по ранее описанному способу снова был выявлен второй пик элюируемых компонентов. Это указывает на стабильность данного диагностического маркера атеросклероза на разных этапах развития заболевания.

П р и м е р 2. Пациент С. 43 года. Обратился в Киевский НИИ кардиологии во время проведения эпидемиологического обследования неорганизованных популяций населения. Во время беседы, клинического осмотра и обследования у данного пациента были выявлены следующие факторы риска ИБС: избыточная масса тела (113 кг при росте 168 см), курение в течение 20 лет в среднем по 10-15 сигарет в день, малоподвижный образ жизни, дислипопротеидемия: общий холестерин - 276,5 мг/дл, общие триглицериды - 177,3 мг/дл, ХС-ЛПВП - 46,5 мг/дл. Холестериновый коэффициент атерогенности - 4,9.

Из сыворотки крови данного пациента выделяли эуглобулиновую фракцию, трижды отмывали ее фосфатным буфером 0,001 М (рН 6,5), а затем делили ее на две субфракции - легко растворимую в 0,14 М растворе хлористого натрия при рН 6,5 и нерастворимую в данных условиях. Нерастворимую в изотонических условиях при рН 6,5 субфракцию сывороточных эуглобулинов растворяли в 0,15 М фосфатном буфере при рН 9,0 и полученный белковый раствор подвергали гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200. Элюирующий раствор - фасфатный буфер 0,15 М (рН 7,2), скорость элюции - 5-6 мл в час. График профиля элюции белков нерастворимой субфракции сывороточных эуглобулинов был представлен одним пиком, компоненты которого выходили в свободном объеме колонки.

Учитывая наличие факторов риска ИБС, данный пациент был взят на учет в группу диспансерного наблюдения. Назначено: соблюдение диеты с ограничением употребления углеводов и продуктов богатых холестерином, расширение двигательного режима, никотиновая кислота в дозе 3 г в день.

На протяжении 3 лет диспансерного наблюдения у данного пациента самочувствие существенно не изменилось, масса тела несколько снизилась до 106 кг, показатели липидного обмена мало изменились по сравнению с исходным исследованием и составляли: общий холестерин - 253,7 мг/дл, общие триглицериды - 160,5 мг/дл, ХС-ЛПВП - 50,2 мг/дл, холестериновый коэффициент атерогенности - 4,0.

При повторном проведении гель-хроматогорафии нерастворимой субфракции сывороточных эуглобулинов на сефадексе G-200 по ранее описанному способу профиль элюции белков остался прежним, а именно элюируемые компоненты выходили в свободном объеме колонки одним пиком. Больной продолжает находиться на диспансерном учете.

П р и м е р 3. Пациент К. 41 год. Практически здоров. Обратился в Киевский НИИ кардиологии во время проведения кооперативного исследования по многофакторной профилактике ИБС среди неорганизованного населения. Масса 82 кг, рост - 177 см. Не курит. Показатели липидного обмена укладываются в пределы физиологической нормы для мужчин данной возрастной группы и составляют: общий холестерин - 218 мг/дл, общие триглицериды - 118 мг/дл, ХС-ЛПВП - 55 мг/дл, ХС-ЛПНП - 140 мг/дл, ХС-ЛПОНП - 23 мг/дл, холестериновый коэффициент атерогенности - 2,9.

Из сыворотки крови данного пациента выделяли эуглобулиновую фракцию, трижды отмывали ее фосфатным буфером 0,001 М (рН 6,5), а затем делили ее на две субфракции - легко растворимую в 0,14 М растворе хлористого натрия при рН 6,5 и нерастворимую в данных условиях. Нерастворимую в изотонических условиях при рН 6,5 субфракцию сывороточных эуглобулинов растворяли в 0,15 М фосфатном буфере при рН 9,0 и полученный белковый раствор подвергали дальнейшему фракционированию на колонке сефадексом G-200. Элюирующий раствор - фосфатный буфер 0,15 М (рН 7,2), скорость элюции - 5-6 мл в час. График профиля элюции белков нерастворимой субфракции сывороточных эуглобулинов был представлен одним пиком, компоненты которого выходили в свободном объеме колонки.

Сделано заключение об отсутствии атеросклеротического повреждения сосудов у данного пациента.

Таким образом, предлагаемый способ может служить надежным методом, обладающим высокой информативностью при ранней диагностике атеросклероза.

Использование: медицина, в частности клиническая биохимия, и может быть использовано для ранней диагностики атеросклероза. Цель: повышение точности способа за счет диагностики атеросклероза в доклиническом периоде. Сущность изобретения: из сыворотки крови пациента выделяют эуглобулиновую фракцию путем диализа, диализат центрифугируют, осадок трижды отмывают 0,01 М фосфатным буфером, добавляют 0,14 М раствор хлористого натрия, вновь центрифугируют, полученный осадок растворяют в 0,15 М растворе фосфатного буфера и подвергают гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200, при появлении на профиле элюируемых компонентов второго пика белка диагностируют атеросклероз. 2 ил.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АТЕРОСКЛЕРОЗА, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет ранней диагностики заболевания, из сыворотки крови выделяют эуглобулиновую фракцию путем диализа против 0,001 М фосфатного буфера, диализат центрифугируют, осадок трижды отмывают фосфатным буфером, добавляют 0,14 М раствор хлористого натрия, вновь центрифугируют, полученный осадок растворяют в 0,15 М растворе фосфатного буфера и подвергают гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200 и при появлении на профиле элюируемых компонентов второго пика белка диагностируют атеросклероз.