СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/92 

Способ относится к области медицины и может быть использован в кардиологии и терапии.

Известны способы прогнозирования течения ИБС путем оценки уровня липопротеинов (ЛП) крови (Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. - Питер. пресс, 1995, с. 98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Шацкая Н. Н. Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн. "Методы исследований в профпатологии". - М., 1988, с. 95-97).

Описанные способы не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами, поэтому не позволяют надежно прогнозировать течение ИБС.

Описан также способ разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Лабораторные методы исследования. Под редакцией Меньшикова В.В. - М.: Медицина, 1987, с. 248 и 249).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом) в комплексе с определением общего ХС крови. Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет выявить ЛП(а), кроме ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ХМ. Это связано с исследованием малого образца сыворотки крови. Концентрация ЛП(а) в крови очень низкая. В способе-прототипе лунка для внесения исследуемого образца сыворотки крови готовится в объеме металлического (стального) бруска с площадью основания 2х20 мм и высотой 10 мм, что не позволяет внести достаточно большой объем сыворотки крови для исследования.

Целью способа является повышение точности способа.

Указанная цель достигается техническим решением, представляющим собой проведение дополнительной инкубации сыворотки крови с красителем суданом Б при температуре 40^oС в темном термостате и исследование образца сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой по сравнению со способом-прототипом, и последующей денситометрией фракций ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой, определение общего холестерина сыворотки крови для одновременного анализа динамики этих показателей.

Новым в данном способе является дополнительная инкубация пробы сыворотки крови с суданом Б в течение часа в темном термостате при температуре 40^oС и заготовка лунки в геле агарозы для внесения исследуемого образца сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой в способе-прототипе. Лунка изготавливается с помощью стального бруска с площадью основания 4х20 мм, а не 2х20 мм как в способе-прототипе одновременно с определением общего ХС крови. Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат.

Дополнительная инкубация сыворотки крови с красителем суданом Б повышает сродство красителя к ЛП крови, а увеличение объема взятого для исследований образца крови позволяет выявить ЛП(а), содержащиеся в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в очень низких концентрациях, что позволяет повысить точность способа и получить желаемый рельтат. Предлагаемый способ позволяет выявлять следующие классы ЛП: ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а), а также оценивать концентрацию общего ХС крови в динамике одновременно с исследованием ЛП крови и проводить последующую денситометрию фракций ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа.

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "практическая применимость", "изобретательский уровень".

В настоящее время особое внимание уделяется одновременному исследованию ЛП(а) и общего ХС крови, в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови, относящийся к апо-β-содержащим липопротеинам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре-β-ЛП (sinking pre-β-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС - 14%, ФЛ - 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид - апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания - противосвертывания крови. При росте концентрации общего ХС и ЛП(а) в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот, ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с β-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин гетерогенен. Все это свидетельствует об особой роли ЛП(а) в атерогенсзе.

ЛП(а) может взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на В, Е-активность ГМК - Ко А редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длиннее, чем у ЛПНП, и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л и обычными методами исследования ЛП(а) определить невозможно. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена.

Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^а, II^б типами гиперлипопротеидемий. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а) и общего ХС крови. Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а). Результаты мировых популяционных исследований показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять ЛП(а).

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения ЛП(а) одновременно с определением ХС крови. В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Лаб. Дело, 1980, 5, с. 287-290). Общий ХС крови определяется унифицированными методами.

Метод определения ЛП(а) основан на электрофоретической подвижности ЛП крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных чертежей.

Способ определения ЛП(а) осуществляется следующим образом поэтапно:
1) приготовление раствора судана Б: 400 мг судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;
2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды при кипячении, затем помещают в термостат при 55^oС; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл веронал-мединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 20х4 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;
3) к 0,3 мл сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40^oС, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55^oС и подогретым вносят в желобок геля агарозы;
4) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4^oС при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;
5) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;
6) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

Общий холестерин крови определяют унифицированным методом в динамике.

Метод основан на измерении оптической плотности вещества, образующегося при взаимодействии холестерола и его эфиров с реактивом Либермана-Бурхарда. Большая часть холестерола находится в сыворотке крови в этерифицированном виде. Продукт реакции холестерола с указанным реактивом поглощает свет в той же области спектра и имеет несколько больший коэффициент экстинкции, чем продукт реакции свободного холестерола для учета этого различия, а также частичного учета матричных эффектов (влияния белков и биллирубина на результаты анализа), калибровка метода проводится по калибровочной сыворотке, содержание холестерола в которой определено референсным методом Абеля-Кендала.

Приготовление реактива Либермана-Бурхарда.

600 мл уксусного ангидрида и 300 мл уксусной кислоты наливают в двухлитровую колбу, помещают в ледяную баню и перемешивают на магнитной мешалке, затем приливают 100 мл охлажденной серной кислоты. Через 30 мин колбу удаляют из ледяной бани, ставят на мешалку и добавляют 20 г сульфата натрия, перемешивают до полного растворения соли 4-5 часов. Реактив стабилен 2 недели.

Ход анализа
1. В сухие пробирки разливают по 5 мл реактива Либермана-Бурхарда, помещают в водяную баню.

2. В первую пробирку наливают 0,2 мл дистиллированной воды (по стенке, медленно в течение 10 минут). Осторожно встряхивают и помещают в водяную баню.

3. С интервалом в 2 мин в остальные пробирки приливают по 0,2 мл исследуемой сыворотки, встряхивают, помещают в водяную баню.

4. Через 25 мин после добавления воды в первой пробирке измеряют оптическую плотность ее содержимого против воды. Далее измеряют исследуемые пробы при длине волны (625±10) нм.

5. Рассчитывают концентрацию холестерина в сыворотках крови по сравнению с калибровочной.

Для растворов продуктов реакции Либермана-Бурхарда закон Бугера-Ламберга-Бера соблюдается в пределах 0-400 мг/дл холестерола.

Количественную оценку фракций при денситометрии проводят следующим образом: определяют площадь каждого пика нахроматограмме по формуле S = h•B1/2h, где S - площадь пика, h - высота пика, B1/2h - ширина пика на половине его высоты.

Расчет проводится автоматически по соответствующей программе и конечным результатом является процентное содержание каждой фракции ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП и ЛП(а), если она есть по отношению ко всей сумме фракций, принятой за 100%.

При проведении повторного исследования после лечения величина фракции ЛП(а) до лечения принимается за 100% и рассчитывается процентное значение величины снижения фракции ЛП(а) после проведенной терапии ИБС.

В группе контроля в случае использования способа-прототипа (n=10) и предлагаемого способа (n= 12) выявлены ХМ, ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП (фиг.1 и 2), так как ЛП(а) у здоровых лиц отсутствует и оценен уровень общего ХС крови, который составил у первых 10 пациентов (4,7±0,2) ммоль/л и у второй группы пациентов (4,4±0,2) ммоль/л. Нами обследованы 2 группы больных ИБС до и после лечения по 10 пациентов для способа-прототипа - I группа и 28 пациентов - II группа для предлагаемого способа.

Диагноз пациентов: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

У пациентов I группы до лечения выявились ХМ, ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП (фиг.3, 4). Уровень ХС сыворотки крови составил у них (7,4±0,5) ммоль/л. После лечения при электрофорезе ЛП фракции ЛПОНП и ЛПНП стали менее интенсивными (фиг. 5, 6).

Уровень общего ХС сыворотки крови после лечения составил (5,8±0,4) ммоль/л. Диагноз после лечения: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II-III. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, но недостаточно точный.

У 22 пациентов II группы выявлены при электрофорезе ЛППП, ЛПОНП, ЛПВП, ЛП(а), ХМ. В случае же использования дополнительно к способу-прототипу только добавочной инкубации исследуемого образца суданом Б 1 час в темном термостате при температуре 40^oС и внесении его в лунку 2х20 мм, либо только увеличении объема лунки до 4х20 мм без дополнительной инкубации пробы фракции ЛПНП и ЛПОНП выявлялись несколько лучше, чем в контроле, а ЛП(а) определялась в виде следовой полосы, что не позволяло ее денситометрировать и, следовательно, оценивать количественно (фиг.7, 8).

У остальных 6 пациентов этой группы фракция ЛП(а) не выявлена. Уровень общего ХС у пациентов всей второй группы составил (8,1±0,6) ммоль/л.

После лечения ИБС у 7 пациентов выявлялась следовая трудно определяемая фракция ЛП(а), у 20 пациентов ЛП(а) не выявлялась.

Уровень общего ХС сыворотки крови после лечения составил во всей группе (6,1±0,5) ммоль/л. Диагноз после лечения у пациентов этой группы (27 человек): ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный. Пациенты этой группы представлены в клинических примерах. У одного пациента второй группы при снижении общего холестерола крови после лечения уровень ЛП(а) в сыворотке крови остался достаточно высоким. Динамики после лечения выявлено не было. Прогноз течения ИБС у этого пациента расценивался как неблагоприятный.

Ложноположительных и ложноотрицательных случаев нами не выявлено, т.к. оценивались только объективные критерии эффективности проводимой терапии ИБС: результаты велоэргометрии, частота приступов стенокардии и соответственно доза принятого нитроглицерина, а также результаты лабораторных методов исследования, выраженные количественно.

Пример 1. Больной Г. 54 года, история болезни 107, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска. Жалобы при поступлении на боли в области сердца и за грудиной колющего характера с иррадиацией под лопатку. Боли возникали при физической нагрузке и снимались нитроглицерином. АД 140/90 мм рт. ст. Пульс в покое - 64 ударов/мин. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по объективным причинам.

Результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 7,7 ммоль/л,
Триацилглицериды - 1,8 ммоль/л,
ХС ЛПВП - 1,2 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по способу-прототипу представлены на фиг.9, а по предлагаемому способу на фиг.10. Фракция ЛП(а) присутствует.

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 5,6 ммоль/л,
Триацилглицериды - 1,6 ммоль/л,
ХС ЛПВП - 1,5 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по предлагаемому способу представлены на фиг.11.

Фракция ЛП(а) отсутствует, фракция ЛПНП слабо выявлена.

Диагноз при выписке: ИБС, стенокардия напряжения, ФК-II. Заключение: лечение эффективное. Прогноз течения ИБС благоприятный.

Пример 2. Больной Д. 55 лет, история болезни 48, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска с жалобами на давящие боли в области сердца и за грудиной, иррадиирующие под лопатку и в шейную область. На ЭКГ значительных изменений не выявлено. ВЭМ прекращена при нагрузке 50 Вт по причине возникшей боли за грудиной. Боли купируются нитроглицерином. На ЭКГ появилась косовосходящая депрессия сегмента ST в отведениях V4-V6. АД 160/110 мм рт.ст., пульс в покое 62 уд. в мин.

Результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 8,2 ммоль/л,
Триацилглицериды - 1,7 ммоль/л,
ХС ЛПВП - 1,0 ммоль/л.

Результаты электрофореза ЛП крови до лечения по предлагаемому способу представлены на фиг. 12. Результаты денситометрии ЛП: ЛПНП - 56%, ЛПОНП - 22%, ЛПВП - 15%, ЛП(а) - 7%.

Диагноз при поступлении: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 6,1 ммоль/л,
Триацилглицериды - 1,5 ммоль/л,
ХС ЛПВП - 1,4 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по предлагаемому способу после лечения представлены на фиг.13.

Результаты денситометрии ЛП: ЛПНП - 56%, ЛПОНП - 25%, ЛПВП - 16%, ЛП(а) - 3%.

Диагноз при выписке: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Снижение уровня ЛП(а) на 57%, а ХС общего на 25% по сравнению с исходным свидетельствовало об эффективности лечения ИБС. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный.

Итак, при применении способа-прототипа прогноз течения ИБС основывался на уровне ХС общего крови и клинических данных, поэтому был недостаточно точным (см. фиг.7 и 8). Способ применен у 38 пациентов и 22 пациентов группы сравнения с диагнозом: нейроциркуляторная дистония. При снижении уровня ЛП(а) на 50% и более и ХС общего в сыворотке крови на 25% и более прогноз течения ИБС был оценен как благоприятный, о чем свидетельствовало изменение функционального класса (ФК) стенокардии напряжения, а при изменении только одного из показателей был установлен неблагоприятный прогноз течения ИБС (переход стабильного течения в нестабильную форму стенокардии).

Ложноположительных случаев прогнозирования течения ИБС при использовании предлагаемого нами способа не наблюдалось. При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования течения ИБС. Определяют в сыворотке крови общий холестерин по оптической плотности вещества, образующегося взаимодействием холестерина и его эфиров с реактивом Либермана-Бурхарда и ЛП(а), путем инкубации сыворотки крови с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС и затем внесения пробы в лунку в геле агарозы с площадью основания 4х20 мм для электрофореза, и при одновременном снижении уровня общего холестерина на 25% и более и ЛП(а) на 50% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения ФК III-IV в ФК I-II, а при снижении общего холестерина менее 25% и уровня ЛП(а) менее 50% по сравнению с исходным уровнем прогноз считают неблагоприятным. Способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов. 13 ил.

Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что до и после лечения определяют в сыворотке крови общий холестерин по оптической плотности вещества, образующегося взаимодействием холестерина и его эфиров с реактивом Либермана-Бурхарда и ЛП(а), путем инкубации сыворотки крови с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС и затем внесения пробы в лунку в геле агарозы с площадью основания 4•20 мм для электрофореза и при одновременном снижении уровня общего холестерина на 25% и более и ЛП(а) на 50% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения ФК III-IV в ФК I-II, а при снижении общего холестерина менее 25% и уровня ЛП(а) менее 50% по сравнению с исходным уровнем прогноз считают неблагоприятным.