Способ диагностики диабетической микроангиопатии Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

раствор с низкой ионной силой - 0,001 М КН РОф-КОН (рН 6,5). Объем диализирующего раствора 400-800 мл. Время диализа 3 сут (первые сутки при комнатной температуре,вторые и третьи - при 4°С в холодильнике) В результате этого эуглобулины сыворотки крови выпадают в осадок,который

15645534

по Оухтерлони или метод двойной радиальной иммунодиффузии по Манчини с применением готовых коммерческих моноспецифических антисывороток лро- 5 тив альфа -гаптоглобина человека,

В случае обнаружения в эуглобу- линах альфа -гаптоглобина ставится диагноз: диабетическая микроангио

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики ангиопатий, и может быть использовано при дифференциальной диагностике диабетических микроангиопатий. Цель изобретения - повышение точности диагностики. При подозрении на диабетическую микроангиопатию у больного производят забор крови из вены в количестве 5 мл, отделяют сыворотку, помещают ее в целлофановый мешок и диализируют, помещая мешок в буферный раствор (0,001 М КН₂РО₄ - КОН при PH 6,2). Время диализа 3 сут (первые сутки - при комнатной температуре, вторые и третьи - при 4°С). В результате эуглобулины выпадают в осадок, который отделяют центрифугированием, отмывают фосфатным буфером и растворяют в 0,5 мл 0,15 М NA₂HPO₄^.2H₂O-KH₂PO₄ - NACL при PH 7,2. С частью раствора эуглобулинов проводят качественную реакцию на присутствие в их составе альфа-гаптоглобина, используя моноспецифическую антисыворотку против альфа₂-гаптоглобина. С этой целью используют иммуноэлектрофорез, реакцию иммунопреципитации в агаре по Оухтерлони или метод двойной радиальной иммунодиффузии по Манчини. В случае обнаружения в эуглобулинах альфа₂-гаптоглобина ставится диагноз: диабетическая микроангиопатия. Метод обладает высокой специфичностью.

собирают после центрифугирования про- JQ патия.

бы при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин,а осадок эу- глобулинов трижды отмывают фосфа т- ным буфером описанного состава путем взбалтывания осадка в буфере и последующего центрифугирования. Отмытый осадок растворяют в буферном фияиологическом растворе 0,15 М NaftHP04x2H40 - КНаР04- - NaCl (рН 7,2) в объеме 0,5 мл. Нерастворенную часть осадка удаляют центрифугированием. С растворимой частью эуглобу- линов проводят качественную реакцию на наличие альфа -гаптоглобина. С этой целью используют иммуноэлектро- форез с применением моноспецифической антисыворотки против альфад-гап- тоглобина человека (например,Аирмы Севак, ЧССР). Электрофоретическое

Пример. Пациент К,, мужчина, 30 лет.

Диагноз: сахарный диабет инсулин- зависимый (1 тип) тяжелой формы в

jc состоянии компенсации (колебания суточной гликемии не более 8-9 ммоль/лл при аглюкозурии).

Из сьюоротки крови данного больного выделяли эуглобулиновую фрак2Q цию, отмывали ее фосфатным буфером 0,001 М (рН 6,5), а затем растворяли в 0,15 М фосфатном физиологическом буферном растворе описанного состава. Полученный раствор сыворо25 точных эуглобулинов подвергали имму- ноэлектрофоретическому анализу, В качестве преципитирующей антисыворотки использования коммерческую моноспецифическую сыворотку против альразделение белков эуглобулиновой фрак- Q фа -гаптоглобина человека (Севак, ции проводят в 1% геле агара, приго- ЧССР). На иммуноэлектрофореграмме товленном на барбиталовом бусЪере (рН 8,6, (Ч 0,05)

следующего состава: 10,3 г веронала натрия (медина- ла) + 1,85 г веронала в 500 мл дис- ,, тшшированной воды, в аппарате для электрофореза агар - гель0 В качестве электронного буфера используют барбиталовый буфер (рН 8,6, /ц 0,085) следующего состава: 10,3 г веронала натрия (мединала) + 1,85 г веронала в 1000 мл дистиллированной воды.После окончания электрофореза в траншею для антисыворотки заливают моновыявляется четкая дуга преципитации в области альфа -глобулинов, что указывает на наличие альфа -гаптоглоби- на в составе белков эуглобулиновой фракции. Поставлен диагноз: диабетическая микроангиопатия.

Для верификации поставленного ди- 4Q агноза у этого больного проводили капилляроскопию и капиллярографию ногтевого ложа пальцев ног и определяли сосудистую проницаемость, а также обследовали сосуды глаз с помощью специфическую сыворотку к альфа -ran- 45 биомикроскопии конъюктивы, прямой и тоглобину и пластины с агаром инку- обратной офтальмоскопии глазного дна бируют в течение 24 ч во влажной ка- с расширенным зрачком Поражения со- мере для прохождения реакции иммуно- судов почек диагностировали на осно- преципитации, которая проявляется вании исследования мочевого осадка в виде характерной дуги преципитации, п путем подсчета форменных элементов

Окраску иммуноэлектрофореграмм осуществляют 0,25%-ным раствором кумаси R-250, приготовленным на смеси метанол - дистиллированная вода - ледяная уксусная кислота в соотношении 5:5:1 Другими способами идентификации апьфа -гаптоглобина в составе сывороточных эуглобулинов являются реакция иммунопреципитации в агаре

55

в трехчасовой и суточной порциях мочи и суточной протеинурии,

В результате обследования был подтвержден поставленный диагноз: диабетическая микроангиопатия II - III ст. Это подтверждает высокую специфичность способа.

П р и м е р 2. Пациент М., мужчина, 46 лет.

патия.

Пример. Пациент К,, мужчина, 30 лет.

Диагноз: сахарный диабет инсулин- зависимый (1 тип) тяжелой формы в

состоянии компенсации (колебания суточной гликемии не более 8-9 ммоль/лл при аглюкозурии).

Из сьюоротки крови данного больного выделяли эуглобулиновую фракцию, отмывали ее фосфатным буфером 0,001 М (рН 6,5), а затем растворяли в 0,15 М фосфатном физиологическом буферном растворе описанного состава. Полученный раствор сывороточных эуглобулинов подвергали имму- ноэлектрофоретическому анализу, В качестве преципитирующей антисыворотки использования коммерческую моноспецифическую сыворотку против альфа -гаптоглобина человека (Севак, ЧССР). На иммуноэлектрофореграмме

выявляется четкая дуга преципитации в области альфа -глобулинов, что указывает на наличие альфа -гаптоглоби- на в составе белков эуглобулиновой фракции. Поставлен диагноз: диабетическая микроангиопатия.

Для верификации поставленного ди- агноза у этого больного проводили капилляроскопию и капиллярографию ногтевого ложа пальцев ног и определяли сосудистую проницаемость, а также обследовали сосуды глаз с помощью биомикроскопии конъюктивы, прямой и обратной офтальмоскопии глазного дна с расширенным зрачком Поражения со- судов почек диагностировали на осно- вании исследования мочевого осадка путем подсчета форменных элементов

в трехчасовой и суточной порциях мочи и суточной протеинурии,

В результате обследования был подтвержден поставленный диагноз: диабетическая микроангиопатия II - III ст. Это подтверждает высокую специфичность способа.

П р и м е р 2. Пациент М., мужчина, 46 лет.

Поступил с диагнозом: ишемическая болезнь сердца; стенокардия напряжения и покоя III-IV функциональный класс. Атеросклероз венечных артерий. НК0о Облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей.

Диагноз верифицирован клиническими, биохимическими и инструментальными методами, включающими электрокардиограмму, велоэргометрию,селек- тибную коронароангиографию.

Больной предъявлял жалобы на чувство жажды, сухость во рту, зуд. В связи с этим был проведен анализ на уровень гликемии и глюкозурии. У болного было выявлено повышение содержания глюкозы в крови натощак и появление глюкозы в суточной порции мочи На основании этого был поставлен диагноз: сахарный диабет легкой формы, впервые выявленный.

Поскольку у данного больного наблюдались выраженные сосудистые поражения, возникла необходимость дифференциальной диагностики ангиопатий с целью выбора адекватной тактики лечения. Для этого пациент был обследован по предлагаемому способу, В результате исследования альфа -гап- тоглобин в составе эуглобулиновой фракции сыворотки крови не был обнаружен, что свидетельствует о том, что сосудистая патология у данного больного не диабетогенного характера. Для верификации заявляемого способа больному проводили дополнительно исследования с помощью широко используемых способов диагностики диабетических микроангиопатий, в результате которых не было выявлено специфических изменений, характерных для сахарного диабета, в сосудах микрециркуляции различной локализации, в частности в сосудах глаз и по- д5 с°ставе эуглобулинов при различных

чек,

Данный пример указывает на то, что при применении предлагаемого способа создается возможность строго дифференцированного подхода в диагностике ангиопатий у больных сахарным диабетом,

ПримерЗ. Пациент Т,, мужчина, 55 лет.

Диагноз: сахарный диабет средней тяжести в состоянии компенсации.Длительность болезни 6 мес.

Во время пребывания в стационаре был обследован на предмет наличия

ангиопатий с помощью капилляроскопии ногтевого ложа пальцев ног,определения сосудистой проницаемости,проведения биомикроскопии конъюнктивы,офтальмоскопии глазного дна,исследования мочевого осадка. На основании данных исследований не было выявлено патологических изменений в сосудах. Параллельно с проведением названного комплекса обследования у данного больного определяли наличие альфа -гаптоглобина в эуглобулиновой фракции по заявленному способу.

5 Реакция на альфа -гаптоглобин положительная.

Через 8 мес от момента обследования этот же больной повторно попал в отделение для стационарного лече0 ния, где при клиническом осмотре был поставлен диагноз: сахарный диабет средне-тяжелой формы, лабильное течение. При осмотре окулистом имело место равномерное расширение век с

5 множественными микроаневризмами,располагающимися по ходу верхнего и нижнего темпорального сосудистого пучка, парамакулярно. Сделано заключение: диабетическая ангиопатия

0 сетчатки, I стадия.

Таким образом, данный клинический пример свидетельствует о том, что альфа -гаптоглобин образуется на стадии Заболевания, когда микроан- гиопатия еще не поддается диагностике, т.е. на самых ранних этапах их образования. Следовательно, появление альфа -гаптоглобина в эуглобулиновой фрающи сыворотки крови является одним из первых признаков формирующейся диабетической микроангиопатий.

В табл.1 представлены данные по определению альфа -гаптаглобина в

5

0

сосудистых заболеваниях, в табл.2 - уровень сывороточных эуглобулинов и качественный аналич на содержание в их составе альфа -гаптоглобина,

Предлагаемый способ обладает высокой специфичностью, поскольку альфае.-гаптоглобин, как видно из табл.1 и следует из приведенных примеров, обнаруживается в составе эуглобулинов только при ангиопатий диабетогенного характера.

Предлагаемый способ имеет существенные преимущества перед прототипом. Как видно из табл.2, само по

себе повышение количества эуглобу- линов в сыворотке крови не может быть надежным критерием для постановки диагноза диабетическая микроангио- патия.

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой специфичностью при диагностике диабетических микро- ангиопатий.

Здоровые доноры Больные сахарным диабетом без признаков поражения сосудовБольные сахарным диабетом с наличием микроангиопатииБольные атеросклерозом без признаков сахарного диабетаБольные гло- мерулонеф- ритом Больные тромбофлебитомБольные тиреотоксикозом

Формула изобретения

Способ диагностики диабетической микроангиопатии путем клинико-лабора- торного обследования, отличающийся тем, что, с целью повыше- /ния точности диагностики, проводят качественное определение альфа -гап- тоглобина в сыворотке крови и при наличии последнего диагностируют диабетическую микроангиопатию.

Таблица 1

О

11

47

62

О

О О О

16

6 6 23

Здоровые донорыБольные сахарным диабетом без признаков поражения сосудов Больные сахарным диабетом с мик- роангиопатия- ми Больные гло- мерулонеф- ритом Больные атеросклерозом

Таблица2

6,,22

10,,09

16,43±4,42 +

14,,11 ll,02i,8