СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДВС-СИНДРОМА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

ДВС-синдром - наиболее распространенный и потенциально опасный вид патологии гемостаза, в основе которого лежит рассеянное свертывание крови в циркуляции с образованием множества микросгустков и агрегатов клеток крови, блокирующих кровообращение в органах и вызывающих в них глубокие дистрофические изменения.

ДВС-синдром вызывают следующие патологические процессы и воздействия: генерализованные инфекции и септические состояния; все виды шока; акушерская патология; иммунные и иммунокомплексные болезни и др.

Для диагностики ДВС-синдрома применяются следующие методы: содержание тромбоцитов крови, этаноловый тест, протамин-сульфатный тест, определение уровня фибриногена и продуктов его деградации (коагуляционные и иммуноферментные). Все эти тесты не обладают высокой специфичностью и чувствительностью.

В качестве прототипа принят метод определения фибриногена и продуктов его деградации при помощи иммуноферментной тест-системы. Метод состоит в определении в плазме крови больного количества фибриногена и продуктов его деградации при использовании антител к фибриногену по методу твердофазного иммуноферментного анализа. В его основе лежит высококонтактное связывание антител к фибриногену с поверхностью полиэстрола, в результате чего она приобретает свойства антительного сорбента, способного извлекать фибриноген и продукты его деградации из биологических жидкостей. Образовавшийся комплекс антител-антитело выявляют с помощью антител, конъюгированных с ферментом. Ферментативная активность измеряется по изменению окраски субстратной смеси, которая регистрируется калориметрически на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Однако существующий способ недостаточно точен, что не позволяет оценить степень тяжести ДВС-синдрома и назначить соответствующую терапию.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что в способе диагностики ДВС-синдрома путем определения в плазме крови больного фибриногена методом иммуноферментного анализа, отличительной особенностью является то, что в плазму крови добавляют гепарин, инкубируют, центрифугируют, полученный осадок разводят в бикарбонатном буфере, после чего наносят на плашку, предварительно покрытую антителами к фибронектину и определяют количество комплексов фибронектин-фибриноген, добавляя антитела к фибриногену в виде конъюгаты, при этом при количестве комплексов 0,24-0,48 мкг/мл диагностируют умеренно тяжелый ДВС-синдром, при 0,12-0,24 мкг/мл - тяжелый, и при 0-0,12 мкг/мл - ДВС-синдром крайней степени тяжести.

Было впервые установлено, что у всех больных с ДВС-синдромом уровень фибронектин-фибриногеновых комплексов был стабильно ниже 0,58 мкг/мл, это легло в основу определения степени тяжести ДВС-синдрома, при этом на основе тех же статистических данных установлено, что при крайней степени тяжести ДВС-синдрома количество комплексов составляет 0-0,12 мкг/мл, при тяжелой степени - 0,12-0,24 мкг/мл, при умеренной степени тяжести - 0,24-0,48 мкг/мл.

Определение степени тяжести ДВС-синдрома позволяет повысить точность диагностики.

Способ осуществляется следующим образом. Взятая от больного плазма крови осаждается гепарином в течение 16-18 ч при 4^оС из расчета на 1 мл плазмы 2 мкл гепарина. Затем плазма центрифугируется со скоростью 3 тыс.об. /мин. в течение 15 мин. Осадок отделяется от супернатанта, отмывается и разводится в бикарбонатном буфере, вновь инкубируется в течение часа в термостате при температуре 37^оС. Разведенные образцы вносят в лунки планшета, предварительно покрытые антителами к фибронектину, по 200 мкл каждого образца в виде лунки вертикального ряда и инкубируют при комнатной температуре в течение получаса, затем тщательно отмывают. Далее во все лунки планшета вносят по 200 мкл раствора конъюгаты антител к фибриногену, осуществляют повторно инкубацию при комнатной температуре в течение 30 мин и вторично отмывают. После этого в каждую лунку планшета вносят субстратную смесь по 200 мкл. Планшет с субстратной смесью выдерживают при комнатной температуре в течение 7-15 мин до появления окраски бледно-желтого цвета. Остановку ферментативной реакции осуществляют последовательным внесением во все лунки по 50 мкл 50%-ной серной кислоты. После завершения ферментативной реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм и при количестве фибронектин-фибриногеновых комплексов 0,24-0,48 мкг/мл диагностируют умеренно тяжелый ДВС-синдром, при 0,12-0,24 мгк/мл - тяжелый и при 0-0,12 мкг/мл - ДВС-синдром крайней степени тяжести.

Способ прошел клинические испытания на кафедре гематологии и интенсивной терапии ЦОЛИУВ на базе ЦКБ N2 МПС. Предлагаемый способ осуществлен у 13 больных, 2 из которых страдали острым миеломонобластным лейкозом, 1 - лимфогранулематозом, 5 - хроническим лимфолейкозом, 3 - острым промиелоцитарным лейкозом, 2 - острым монобластным лейкозом. У всех больных состояние осложнилось развитием сепсиса, ДВС-синдрома. Во всех случаях уровень фибронектин-фибриногеновых комплексов не превышал 0,58 мкг/кл.

Для подтверждения преимуществ предлагаемого способа по сравнению с известным приводим сопоставительные данные диагностирования степени тяжести ДВС-синдрома, сделанные на основе предлагаемого и известного методов, при разделении всех оценок на 3 степени. Исследования проводились в одной и той же группе больных, результаты сведены в таблицу.

Таким образом, как видно из таблицы, известным способом не определялась степень тяжести ДВС-синдрома, а констатировалось лишь его наличие. Предлагаемый способ позволил определить степень тяжести ДВС-синдрома.

П р и м е р 1. Больная Б., 50 лет. Диагноз: острый миеломонобластный лейкоз. Сепсис. Септический шок. ДВС-синдром. Больна в течение полугода. Ремиссии не получено. После очередного курса ПХТ на фоне агранулоцитоза развился сепсис, септический шок, ДВС-синдром. Взятая от данной больной плазма крови в количестве 1 мл инкубировалась с 2 мкл гепарина в течение 18 ч при 4^оС, затем центрифугировалась со скоростью 3 тыс. об/мин в течение 15 мин. Отделенный от супернатанта осадок был отмыт и разведен в бикарбонатном буфере путем инкубации в течение часа в термостате при температуре 37^оС. Разведенный осадок был внесен по 200 мкл в две вертикальные лунки планшета, предварительно покрытые антителами к фибронектину, проинкубирован при комнатной температуре в течение получаса. В отмытые затем лунки была внесена по 200 мкл в каждую субстратная смесь конъюгата антител к фибриногену, повторно инкубирована в течение 30 мин и отмыта. После этого в лунки планшета внесена субстратная смесь по 200 мкл. Планшет с субстратной смесью выдержан при комнатной температуре 10 мин до появления окраски бледно-желтого цвета. Остановку ферментативной реакции осуществили внесением в каждую лунку по 50 мкл 50%-ной серной кислоты. Оптическую плотность субстратной смеси измерили на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм и, использовав калибровочную кривую, получили значение 0,12 мкг/мл фибронектин-фибриногеновых комплексов, на основании чего была диагностирована крайне тяжелая степень ДВС-синдрома. Несмотря на проводимую терапию: антибиотики, плазмаферез с адекватным плазмозамещением, дополнительное введение донорской плазмы, гепарина, исход летальный.

П р и м е р 2. Больной П., 34 года. Диагноз: лимфогранулематоз IV Бб, смешанно-клеточный вариант. Тиреотоксикоз. Сепсис. ДВС-синдром. Болен в течение 5 лет. В лечении использованы ПХТ, спленэктомия, лучевая терапия. Последнее ухудшение в течение месяца. ПХТ без эффекта. На фоне опухолевой и медикаментозной панцитопении появились клинические признаки пневмонии, развился сепсис, ДВС-синдром. Уровень фибронектин-фибриногеновых комплексов в плазме крови данного больного составил 0,20 мкг/мл, на основании чего ДВС-синдром расценен как тяжелый. Больной скончался ввиду прогрессирования основного заболевания в связи с тем, что на фоне опухолевой панцитопении не удалось справиться с рецидивирующими инфекционно-септическими и геморрагическими осложнениями.

П р и м е р 3. Больная Ф., Диагноз: острый промиелоцитарный лейкоз, острая левосторонняя нижнедолевая пневмония. Сепсис. ДВС-синдром. Диагноз установлен впервые. После первого курса ПХТ на фоне агранулоцитоза появились признаки пневмонии, развился сепсис, ДВС-синдром. Уровень фибронектин-фибриногеновых комплексов составил 0,40 мкг/мл, на основании чего ДВС-синдром квалифицирован как умеренно тяжелый, после купирования инфекции с ним удалось справиться с помощью плазмофереза, плазмообмена, введения гепарина.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества: известный способ не является достаточно точным, так как по определению фибриногена судят только о наличии синдрома или об его отсутствии, в результате чего нет возможности назначить адекватную терапию, а предлагаемый способ является более точным, он позволяет за счет определения фибронектин-фибриногеновых комплексов оценить тяжесть синдрома, при этом получить конкретные количественные критерии, опираясь на которые, можно назначить дифференцированное лечение.

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и общей терапии для выявления степени тяжести лечения диссеменированного внутрисосудистого свертывания (ДВС). Цель - повышение точности способа за счет выявления степени тяжести ДВС. Для этого плазма крови осаждается гепарином, осадок отделяется от супернатанта, отмывается и разводится в бикарбонатном буфере. Разведенные образцы вносят в лунки планшета, предварительно покрытые антителами к фибронетину, далее во все лунки планшета вносят конъюгаты антител к фибронектину с ферментом. После этого в каждую лунку планшета вносят субстратную смесь. После завершения ферментативной реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм и при количестве фибронектин-фибриногеновых комплексов выше 0,24 - 0,48 мкг/мл диагносцируют течение средней тяжести, при 0,12 - 0,24 мкг/мл - тяжелое течение, ниже 0,12 мкг/ мл - ДВС-синдром крайней степени тяжести. Способ позволяет выявить степень тяжести заболевания. 1 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДВС-СИНДРОМА, включающий добавление плазмы крови больного к противофибриногеновым антителам с последующим выявлением комплекса антиген-антитела с помощью антител, коньюгированных с ферментом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в плазму крови предварительно вносят гепарин, инкубируют, центрифугируют, растворяют осадок в бикарбонатном буфере и добавляют к противофибронектиновым антителам, связанным с носителем, далее вводят коньюгат антифибриногеновых антител и фермента, выявляют фибронектин-фибриногеновый комплекс и при количестве комплекса выше 0,24 - 0,48 мкг/мл диагностируют ДВС-синдром средней тяжести, при количестве 0,12 - 0,24 мкг/мл - тяжелое течение и при количестве комплекса ниже 0,12 мкг/мл - крайне тяжелое течение ДВС-синдрома.