СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УГЛЕВОД-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/56 

Изобретение относится к биоорганической химии и касается получения биологически активных препаратов из животного сырья.

Как установлено, большинство из известных низкомолекулярных противоопухолевых препаратов являются высокотоксичными иммунодепрессантами, при этом угнетающее иммуногенез действие этих агентов обусловлено повреждением лимфоидной ткани. Напротив, высокомолекулярные полисахариды и гликопротеины, полученные экстракцией из высших растений, грибов, бактерий, водорослей, дрожжей, лишайников и других природных объектов, имеют низкую токсичность и проявляют активность, особенно против имплантируемых твердых опухолей. Однако спектр их противоопухолевых свойств узок, а активность индуцируется организмом в ответ на воздействие биологически активного вещества. Большинство из этих препаратов не показывает прямой цитотоксичности против культивируемых клеток опухоли, что является одной из причин того, почему исследования в этой области не проводились так активно, как это должно было быть [1].

Идеальный противоопухолевый препарат должен был бы обладать избирательной токсичностью по отношению к опухолевым клеткам, но не повреждать при этом клеток лимфоидной системы, которые необходимы для мобилизации защитных сил организма, а также усиливать иммунитет, т.е. проявлять иммуностимулирующую активность.

Известен способ получения противоопухолевого препарата из моллюсков, представляющего собой смесь водорастворимых макромолекулярных гликопротеидов [2]. Сущность способа заключается в том, что из жидкости, оставшейся при варке моллюсков, обычно отбрасываемой как отход, получают концентрат или сухой порошок и из него выделяют целевую гликопротеидную фракцию. Препарат, полученный данным способом, не проявляет иммуностимулирующую активность.

В качестве прототипа выбран способ получения противоопухолевого вещества из приморского гребешка Patinopecten yessoensis, заключающийся в извлечении органов моллюска из раковины, их варке в течение 30 минут, измельчении и гомогенизации в воде в течение 15 минут при 0^oC с последующим измельчением на ультразвуковой установке. Полученную смесь центрифугируют, затем супернатант подвергают ультрафильтрации и собирают фракции с молекулярным весом более 300000. Последующая ультрафильтрация фильтрата позволяет получить фракции с молекулярным весом 10000-300000. После сублимационной сушки получают вещество с выходом 0,085% от сырого веса исходного материала. Полученное вещество представляет собой гликопротеид, обладающий противоопухолевой активностью по отношению к имплантируемым мышам опухолям.

Недостатком известного способа является практически полное отсутствие токсичности полученного препарата против опухолевых клеток и отсутствие какого-либо заметного эффекта на иммунную систему организма, вследствие чего рекомендуется повышать эффективность препарата одновременным стимулированием иммунной активности другими средствами, Указанные недостатки снижают достоинства способа.

Задача изобретения - разработать способ, который обеспечил бы получение углевод-белкового комплекса с более высокой противоопухолевой активностью, обладающего также иммуностимулирующей активностью.

Поставленная задача решена тем, что в способе получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка Patinopecten yessoensis, включающем извлечение органов моллюска из раковины, измельчение, гомогенизацию, центрифугирование и выделение целевого продукта, предварительно моллюска облучают ультрафиолетовым излучением в дозе 8,2-8,6 кДж/м² с последующим его содержанием в естественной среде обитания в течение 22-26 ч, а после гомогенизации осуществляют экстракцию целевого продукта физраствором с последующим его диализом и лиофилизацией.

Полученный препарат, по данным хроматографии и анализа, представляет собой смесь высокомолекулярных водорастворимых гликопротеиновых соединений с молекулярной массой 10-100000 (по данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), содержанием углеводов 1-15%, обладающую высокой противоопухолевой и иммуностимулирующей активностями.

В концентрации 0,05 мг/мл он на 55% подавляет рост опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro по сравнению с 3% в контроле (необлученный гребешок). При концентрации 0,5 мг/мл ингибирование роста опухолевых клеток достигает 85%, причем этот вид активности связан с лизисом опухолевых клеток. При введении в организм мыши в дозе 10 мг препарат усиливает функциональную активность макрофагов, выражающуюся в подавлении на 95% роста опухолевых клеток карциномы Эрлиха, культивируемых in vitro совместно с извлеченными макрофагами. При этом активность препарата, полученного из необлученных моллюсков, в аналогичных испытаниях на 45% ниже.

Препараты, полученные из облученных и контрольных животных, проявляют в этом тесте прямо противоположные свойства: первые - иммуностимуляторов, активирующих макрофаги, вторые - иммунодепрессантов, угнетающих активность макрофагов по отношению к опухолевым клеткам. В концентрации 1-5 мг/мл препараты, полученные из облученных животных, проявляют митогенную активность, что проявляется в стимуляции лимфоцитов в реакции бласттрансформации, средний индекс стимуляции составляет 1,9. Препараты из контрольных необлученных животных угнетают пролиферацию лимфоцитов (средний индекс стимуляции - 0,3).

В указанном диапазоне доз излучения биологическая активность полученных препаратов достигает наибольшей величины. Выбор времени инкубации облученных животных диктовался теми же причинами.

В отличие от пути, по которому поиск средств противоопухолевой защиты сводится к обширному скринингу многочисленных классов веществ синтетического и природного происхождения, в предлагаемом способе для тех же целей используются соединения, образующиеся в процессе естественной защиты организма от повреждающего воздействия излучения.

Предлагаемый способ позволяет получить из доступных видов морского сырья - не используемых в пищу органов промысловых моллюсков (мантия) - препарат, обладающий противоопухолевой и иммуностимулирующей активностями, который может быть использован для стимуляции защитных сил организма при новообразованиях.

Существенное отличие способа состоит в облучении моллюска и непременном обеспечении его жизнедеятельности в течение нескольких часов. Облучение изолированных органов моллюска не приводит к увеличению активности получаемого гликопротеинового препарата.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Створки раковин приморского гребешка Patinopecten yessoensis закрепляют в полуоткрытом состоянии и через образовавшийся зазор облучают тело животного светом бактерицидной лампы с длиной волны излучения 254 нм на расстоянии 15 см от источника света в воздушной среде в течение 5 мин, что соответствует дозе облучения 8,4 кДж/м². Облученных и контрольных необлученных животных содержат в естественной среде обитания в течение 24 ч, после чего вскрывают раковины, извлекают мантии, промывают последовательно пресной и дистиллированной водой, измельчают, взвешивают (1,0 кг) и гомогенизируют с 0,9%-ным охлажденным раствором хлорида натрия (соотношение экстрагируемый материал : экстрагент = 1 : 5) в течение 5 мин, затем добавляют 0,9%-ный раствор хлорида натрия в соотношении исходный материал : экстрагент = 1 : 5. Экстракцию проводят при температуре 4-6^oC в течение 9-12 ч, периодически перемешивая смесь, после чего отделяют твердые частицы центрифугированием в течение 30-40 мин при 20000 об/мин. Нерастворившийся материал отбрасывают, а осветленный супернатант диализуют через целлофан против дистиллированной воды при температуре 4-6^oC до полного удаления хлорид-иона. Диализат центрифугируют при 20000 об/мин и высушивают на лиофильной сушке. Полученный углевод-белковый препарат представляет собой легкий, слегка окрашенный, легко растворимый в воде, буферных и солевых растворах порошок. Выход составляет 1,2% от веса исходного материала.

Выделенный аналогичным способом препарат из контрольного образца служил базой сравнения.

Химический состав опытного и контрольного образцов препарата представлен в табл. 1.

Существенные отличия в составе суммарных экстрактов выявляются при исследовании на аналитической центрифуге. Так, при ультрацентрифугировании в течение 18 мин при 50000 об/мин в физрастворе обнаруживается четко регистрируемый пик в полученном препарате при отсутствии такового в контроле.

Однако самые большие различия обнаруживаются при определении физиологической активности. Противоопухолевая активность полученных препаратов определялась по ингибированию роста опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха в опытах in vitro и in vivo.

Опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха извлекались шприцeм из перитональной полости мыши-опухоленосителя и суспендировались в культуральной среде RPMJ 1640, дополненной 10%-ной телячьей эмбриональной сывороткой, пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл). Жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего и составляла во всех опытах не менее 90%. В стерильные пробирки вносилось по 1•10⁵ опухолевых клеток в 1 мл культуральной среды, добавлялись растворы испытуемых веществ и ¹²⁵J-дезоксиуридин, 0,04МБК (удельная активность препарата 40000 ТБК/моль), после чего пробы инкубировались 4 ч при 37^oC в атмосфере влажного воздуха с 5% CO₂. По окончании инкубации невключившаяся радиоактивность отмывалась охлажденным 0,9%-ным NaCl, смесь центрифугировалась при 900 об/мин в течение 10 мин, надосадочная жидкость удалялась и радиоактивность осадков подсчитывалась на γ-счетчике.

Уровень радиоактивности осадка служил мерой роста опухолевых клеток. Результаты определений представлены в табл. 2.

Исследование цитостатической активности препарата в зависимости от дозы излучения при инкубации животных в течение 24 ч показало, что максимальное ингибирование опухолевого роста наблюдается в интервале доз 8,2-8,6 кДж/м², что в условиях эксперимента соответствует 4,5-5,5-минутному времени облучения. При увеличении дозы облучения наблюдается значительный спад цитостатической активности вплоть до практически полной ее потери. При дозах ниже 8,2 кДж/м² наблюдалась аналогичная картина (табл. 3).

В опытах in vivo определялась опосредованная макрофагами цитостатическая активность препаратов по отношению к опухолевым клеткам. Мышам линии CBA в брюшную полость вводилось известное количество исследуемого вещества в 2 мл физиологического раствора, контрольным - 2 мл физраствора. Через определенные промежутки времени после инъекции мыши умерщвлялись цервикальной дисклокацией, фиксировались на доске и в перитонеальную полость вводилось по 3 мл культуральной среды 199 со 100 ед/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, а также воздух. После массажа брюшной полости в течение 2-3 мин шприцeм отбирались перитонеальные экссудаты, переносились в чашки Петри, где инкубировались при 37^oC в течение 1 ч в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% CO₂. Не прилипшие клетки снимались с чашек Петри путем трехкратного промывания культуральной средой. Популяция прилипших макрофагов снималась резиновым скребком и использовалась в эксперименте. В стерильные пробирки, разделенные на три серии (а, б, в) вносилось: а) 1•10⁵ опухолевых клеток и 2•10⁶ активированных исследуемым препаратов макрофагов, б) 1•10⁵ опухолевых клеток, в) 2•10⁶ активированных макрофагов. Контролем служили пробы, содержавшие: а) 1•10⁵ опухолевых клеток и 2•10⁶ интактных (не активированных) макрофагов, б) 2•10⁶ интактных макрофагов. Объем смеси в каждой пробирке составлял 1 мл. Пробы инкубировались в культуральной среде, дополненной 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, при 37^oC в течение 18-20 ч в атмосфере влажного воздуха с CO₂. За 4 ч до окончания инкубации в пробирки вносилось по 0,15 МБК ³H-тимидина. Включение метки в пробах прерывалось путем помещения их на лед и добавкой 5 мл охлажденного физиологического раствора, клетки ресуспендировались и осаждались центрифугированием при 900 об/мин в течение 10 мин. Надосадочные жидкости сливались, после чего к каждой пробе добавлялось по 0,2 мл 0,3N NaOH, смеси нагревались при 70^oC в течение 1,5 ч. После охлаждения, аликвоты (50-200 мкл) жидкости из каждой пробирки наносились на пронумерованные диски из фильтровальной бумаги, диски просушивались, затем последовательно проводились через охлажденный 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, промывались дважды этиловым спиртом, эфиром, высушивались и помещались в толуольный сцинтиллятор для подсчета радиоактивности на β-счетчике. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток определялось по формуле:
% ингибирования = (N_оп.кл+N_м-N_см / N_оп.кл)100,
где
N_оп.кл - скорость счета опухолевых клеток, имп/мин,
N_м - скорость счета макрофагов, имп/мин,
N_см - скорость счета опухолевых клеток с макрофагами, имп/мин.

Результаты эксперимента представлены в табл. 4.

Как видно из данных табл. 4, макрофаги, активированные экстрактом облученного гребешка, практически полностью ингибируют опухолевый рост. Экстракты необлученного гребешка оказывают иммунодепрессантное действие и подавляют активность макрофагов в противоопухолевой защите. Таким образом, этот эксперимент доказывает иммуностимулирующие свойства препарата, полученного по предлагаемому способу, и его существенные отличия от прототипа.

Стимуляция лимфоцитов оценивалась в реакции бласттрансформации по общепринятой методике [3]. Препарат, полученный по предлагаемому способу, обладает митогенным действием и в концентрации 1-5 мг/мл стимулирует лимфоциты. Индекс стимуляции составил 1,9 по сравнению с 0,3 по известному способу.

Цитотоксическая активность препаратов оценивалась по окрашиванию трипановым синим клеток асцитной карциномы Эрлиха. Данные определений представлены в табл. 5.

Список литературы
1. Proceeding of the thirol Annual MYT Sea Grant College. Program Zecture and Seminar (ed.by Rita R. et al, W-w-J-Z, 1985, p. 377-388.

2. Патент США N 4390468, A 23 J 1/04, C 07 C 7/00, опубл. 28.06.83, "Способ получения противоопухолевого препарата из моллюсков".

3. Патент Японии N 8088/82, A 61 K 35/56, "Антиопухолевое вещество и антиопухолевое средство, эффективным компонентом которого является это вещество.

Приморский гребешок Patinopecten yessoensis облучают ультрафиолетовым излучением в дозе 8,2-8,6 кДж/м² с последующим его содержанием в естественной среде обитания в течение 22-26 ч. После этого мантию моллюска извлекают из раковины, измельчают, гомогенизируют, затем экстрагируют физраствором, диализуют и лиофилизируют. Способ обеспечивает получение препарата, обладающего противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью. 5 табл.

Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка Patinopecten yessoensis, включающий извлечение органов моллюска из раковины, измельчение, гомогенизацию, центрифугирование и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что предварительно моллюска облучают ультрафиолетовым излучением в дозе 8,2 - 8,6 кДж/м² с последующим его содержанием в естественной среде обитания в течение 22 - 24 ч, а после гомогенизации осуществляют экстракцию целевого продукта физраствором с дальнейшим его диализом и лиофилизацией.