Способ серологической диагностики алеутской болезни норок Советский патент 1990 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринаии, а точнее к п етерниарной пирусо- ргни. . Целью изобретения лиллется попы- j енне чувствнтельности способа.

Поставленная цель достигается тем, то согласно способу диагностики алеутской болезни норок, включающему реакцию преципитации комплекса анти- 10 ен-аптитело, сыворотку крови Ж1гоот- ного смешивают с известным количеством mTat-fl-ia П- вируса алеутской болезни, который предварительно концентрируют ультрафильтрацией, npo№i- 15 вают буфером, повторно концентрируют ультрафильтрацией, иодируют изотопом известным методом,

Пример 1. Анализируемые пробы сыворотки крови живо.тных раствори-20 ют в буферном растворе с рП 7,А-7,5, добавляют извест юе количество штамма П-1 вируса алеутской болезни, который предварительно концентрируют ультрафильтрацией до 0,1 первоначаль-25 ного объема, затем разбавляют восьмикратным избытком фосфатного буфера с рН 7,0, снова концентрируют полученную суспензию ультрафильтрацией в 8 раз и далее иодируют известным зО способом с помощью На в присутствии хлорамина Т и метабисульфата натрия. Процесс проводят в течение 20 мин при 0°С при перемешивании. Пол шнный меченый радиоактивным, ио- . ДОМ препарат.вируса очищают от неСвя- завшегося радпоактивногр иоДа гель фильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Смесь сыворотки с иодированным штаммом П-1 вируса алеутской болезни Q инкубируют в течение 1 ч при 18°Cj виосят раствор полизтиленгликолп для осаждения образовавшегося комплекса антиген-антитело,. осадок отделяют центрифугированием и радиоактивность, 45 Служащую мерой содержания антител, считают на автоматическом счетчике. Заключение о состоянии животного делают на основании сравнения результатов контрольных и анализируемых проб.

50

Как следует, из вышеизложенного для осуществления предлагаемого способа диагностики алеутской болезни норок ETat-iM-n-1 необходимо предварительно подвергнуть концентрированию, ультрафильтрацией, промывке б фером5 повторному концентрированию ультрафильтрацией.

Q 5

0

5

Последующее иодирование штамма П-1, подвергшегося тякоП обработке, приводит к нолучен1по штамма П-1 с высокой удельной радиоактивностью, который при инкубации с сывороткой крови способен давать им }унологичес- кий комплекс, обнаруживаемый по радиоактивности.

Удельная радиоактивность иодированного штамма П-1 составляет 33,5 ГБК на ; 1 г белка, объемная актив- ; ность 4,02 ГБК/л, массовая концентрация г бел5са/л, степень иодирования близка к единице.

При этом показано, что иодирование штамма П- без предварительного концентрирования ультрафильтрациёй, промьшки буфетзом, повторного концентрирования не приводит к включению радиоактивного иода в антиген.

.Иодированиьй Bitpyc сохраняет антигенные свойства исходного препарата, что показано методами иммуноэлектро- осмофореза и радиоиммунопреципиТации.. Степень связывания со специфическими антителами составляет приблизительно. 70%. Он не обладает инфеАкциопностью, что особенно ценно при работе с таким опасным возбудителем, каким является характеризующийся множествен- .иостыо путей распределения распространения вирус алеутской болезни, устойчивьп к воздействию ряда химических веш.еств, TehinepaType и колебаниям рП, к прогреванию при 56 С и действию ферментов.

П р и м е р 2. 2 мл антигена, . вьшускаемого биопром)Ш1ленностью для серологической диагностики алеутской болезни норок, представляющего собой стерильньш, не обладающий инфек- ционностью штамм П-1 вируса алеутской болезни норок, помещают в установку для ультрафильтрации и фнльт- pyioT через мембрану Рипор МВ-1 с диаметром пор 100-150 (г. Олайне), уменьшая первоначальный объем до 0,4 мл. Затем добавляют А мл фосфатного буфера (0,1 М натрнй-фосфат1Пз1й буферный раствор с рП 7,01 и снова . концентрируют ультрафильтрацней до 0,4 мл.

Смешивают подготовленный антиген с 80 М1(Б (без носителя, молярная активность 62000 ТБК/моль), растворенного в 0,1 1-ш 0,1 Н натрий-фос-, фатногб б уф ёра, и 0,1 мл свежеприготовленного раствора хлораминй Т

(2 мг/ьш jj 0,05 М фосфатном буфере с рН ). Инкубируют 20 мин njJH 0°С при перемешивании. Добавляют . 0,4 мл раствора метабисульфата натрия (2,А мг/мл я 0,05 К фосфатном буфере), затем 0,1 мл 0,1 М раствора К1 в 0,1 М фосфатном буфере. смесь в колонку.размером 1x40 см с сефадексом G-50 и элюируют эабуфе- ренным физиологическим раствором (0,9%-ный NaCl). Проводят непрерьш- ную регистрацию содержания белка в элюате с помощью проточной УФ-абсорб- цйонной кюветы. Собирают фракции объемом I мл и измеряют в них радиоактивность на у-счетчике. Гель-фильтрация позволяет полностью отделить меченый антиген от низкомолекулярных радиоактивных примесей. При отсутствии проточного спектрофотометра, фракции, содержащие антиген, можно определить визуально, так как они имеют отчетливый желтый цвет. Их объединяют, разбггйляют физиологическим раствором, содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, до уровня счета аликвоты объемом 5 мкл примерно 10 имп./мин и хранят при .

В пробнркн (пластиковые или стеклянные} вносят по 300 мкл фосфатного буферного раствора с рП 7,4, имеющего следующий состав: Na5HPO f 2H.jO . 10,6 г; натриевая соль этилендиамин- тетрауксусной кислоты 2Н(0 3,73 г; бычий сывороточный альбумин 1 г, вода дистиллированная до 1 л.

Кровь норок, отобранную для исследования в стеклянные стандартные

капилляры (1 X 70 мм), центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 5 мин, отламьшают часть капилляра с сывороткой н осторожно выдувают содержимое при помощи специальной груши или резиновой трубки в пробирки с подготовленным фосфатным буфером. Объемы вносимых для исследования сывороток в данном эксперименте сос- тавдяли 20 мкл. Одновременно для контроля реакции готовятся серии

проб, содержание: 1) 20 мкл стандартной сыворотки здорового животного, (контроль неспецефического связывания); 2) 20 мкл стандартной сьшо-. ротки больного животного (контроль специфического связывания); 3) 20 мкл буферного раствора (контроль радиоактивности). Для получения достоверных результатов же;,1ательно нее пробы дублировать. Далее в пробирки с пробами добавляют по 200 мкл меченого J штамма П-1 алеутской бо- лезнн Са:;тивность 1340 Бк). Предварительно подбирают разведение мечепо- го антигена, обеспечивающее полное связьтание антител в пробах в иммунные комплексы. В данном случае счет вносимой аликвоты составлял 60000 имп./мин.

Пробирки после перемешивания содержимого оставляют на 1,5 ч при кон5 натной температуре, затем в каждую добавляют по 1 мл 20%-ного раствора полнэтиленглнколя 1мол.М 6000) для осаждения иммунного комплекса,iвстря- хийают и центрифугируют 15 мин при

0 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирки переворачивают н помещают отверстиями вниз на сложенную в несколько слоев фильтрованную бумагу для наиболее полного удаления

5 жидкости. Радиоактивность осадков .считают на автоматическом f -счет- чике.

Результаты типичного опыта представлены в табл.1.

На примере анализа крови 30 животных показаны различия между тяжело больными живо тными, здоровыми и теми, у которых C4et радиоактивности, отражающий содержание антител в крови, имеет промежуточные значения.

Одновременное определение тех же образцов по РИЭОФ показало, что поло- Q жительную реакцию дают только животные с тяжелой .формой заболевания, т.е. имеющие высокий титр антител. В группе животных с ранними формами заболевания по прошествии месяца с -момента обследования были- зарегистрированы случаи заболевания, дающие положительную реакцию на РИЭОФ. Эти наблюдения позволяют считать, что предлагаемый способ можно использовать для ранней диагностики

45

50

55

алеутской болезни.

Параллельное обследование 1144 норок из зараженного стада обоими способами показало, что выявляемость тяжелых форм заболевания в 3,3 раза, а всех форм с повьшенньгм содержанием антител в 40 раз выше по предлагаемо- tty способу, чем по РИЭОФ (табл.2).

Счет радиоакптностй произподился пау-счетчике Гамма-Трэк - 1191 с аптоматич« ской смепоП проб, мимималь «ым премеием счета 10 с и выводом информации и стандартнэовапион виде/

Таким образом пред ложешшШ способ позволяет проводить рашпого диагностику алеутской болеэии, сиизить расход антигеиа и автоматизировать процесс.

I

Расход меченого антигеиа на одно определение составляет ft lO г (по содержанию белка). Из стандартной дозы вьтускаемого биопромьшшенностью антигеиа, рассчитАнной на 2500 определений по реакции им1 уноэлектро- осмофореза, можно получить меченый иодом антиген на 30000 определеиий по предлагаемому, способу.

6

ла изобретепия серологической диагностики

алеутской болезни порок, включающий отбор крови у животных, получение из нее сыворотки с пocлeдyroщ гми постановкой реакции между сывороткой и антигеном и анализом результатов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, антиген перед постановкой реакции концентрируют до 0,1-0,2 первоначального объема, затем разбавляют в 8-10 раз фосфатным буфером с рН 7,0, после чего повторно концентрируют ультрафильтрацией в 8-10

j«5

раз и иодируют изотопом

для

проведения реакции смесь антигена и сьшоротки инкубируют в течение 115

20 1,5 ч, затем осаждают, а анализ результатов осуществляют по радиоактивности полученного осадка/

Изобретение относится к ветеринарии, а точнее к ветеринарной вирусологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для осуществления способа антиген, содержащий инактивированный вирус алеутской болезни норок, предварительно концентрнругот, проньшают буфером, повторно концентрируют ультра-фильтрацией и иодируют изотопом с помощью NaJ в присутствии хлорамина Т и метабисульфата натрия.. После добавления указанного антигена к исследуемой сьюоротке указанную смесь инкубируют-в течение 1-1,5 ч, отделяют, осадок цеитрифугированием и измеряют его радиоактивность, которая и служит мерой содержания . антител в исследуемой сыворотке. 2 табл. с

Т а б л и ц J а I Результаты исследования Образцов крови норок

Счет радиоактивности, ими./мин

4300

А250

26300

17500

16600

13050

5500

10200

9600

8000

8700

7500

6800

14276518

Таблице 2

Срапнительное нэучекне диагностической ценности способов

Предлагаемый

Прототип(РИЗОФ)

66 19

248 О