СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С Российский патент 1998 года по МПК A61K35/36 

Изобретение относится к биотехнологии.

Известен способ получения цитохрома C (авт. св. N 351546, кл. A 61 K 35/34) из сердец крупного рогатого скота. Способ включает измельчение сердца в фарш, экстракцию цитохрома C трихлоруксусной кислотой при pH 3,8-4,1; 2 высаливания балластных белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохромата C 20%-ным раствором трихлоруксуной кислоты, отделение осадка центрифугированием. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают, размораживают и отфильтровывают, далее крепкий раствор цитохрома C оставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор стерилизуют, фильтруют, фильтрат разводят физраствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мл, стерильно фильтруют, разливают во фланцы и лиофилизируют.

Этот способ не позволяет выделить цитохром из сердца гидробинтов.

Наиболее близким техническим решением является способ получения цитохрома C [1] Способ включает измельчение сердца морского котика в фарш, экстракцию цитохрома C трихлоруксусной кислотой при pH 3,8 4,1, нейтрализацию гидроксидом натрия до pH 6,0-7,0, высаливание балластных белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома C 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, обработку осадка насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугирование, отделение осадка центрифугированием. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают, размораживают и отфильтровывают, далее крепкий раствор цитохрома C ставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор стерилизуют, фильтруют, фильтрат разводят физраствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мг, стерильно фильтруют, разливают во флаконы и лиолифилизируют.

Недостатком этого способа является невозможность выделения цитохрома C из сердца гидробионтов.

Задача, решаемая изобретением, получение цитохрома C из нового сырья - сердец гидробионтов, в котором аминокислотный состав соответствует цитохрому C человека.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

В качестве сырья используют сердце лососевых пород рыб. Сырье промывают от крови, измельчают (гомогенизируют). Фарш также отмывают от крови. К полученному фаршу добавляют 2,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или 2% -ной серной кислоты до pH 4,8-5,5. Экстракт в течение 2 ч при периодическом перемешивании.

В экстракционную массу добавляют природный адсорбент-перлит в соотношении 4: 1. Экстракт отделяют фильтрованием, добавляют гидроокись натрия до pH 7,0 и осаждают белки кристаллическим сульфатом аммония.

К фильтрату добавляют 20%-ный раствор ТХУ или 10% H₂SO₄. Выпадает осадок, который отделяют центрифугированием. Осадок обрабатывают раствором сульфата аммония и центрифугируют. Осадок цитохрома C растворяют в дистиллированной воде и замораживают при температуре минус 10 15^oC, затем размораживают и фильтруют. Крепкий раствор цитохрома C ставят на диализ. Полученный раствор нагревают и фильтруют. Фильтрат разводят физиологическим раствором, стерильно фильтруют во флаконы и лиофилизуют.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

К 300 г фарша сердец лососевых (вид Oncorhynchus keta) добавляют 2,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,85 при t=18^oC и два часа экстрагируют при периодическом перемешивании. В конце экстракции в экстракционную массу добавляют 60 г (из расчета 20 г на 100 г сырья) обработанного перлита марки Sil Flo 272. Выдерживают 30 мин. Экстракт отделяют на нутч-фильтре. Объем экстракта 280 мл.

Для нейтрализации экстракта в него добавляют 10% NaOH до pH 7,05. Осаждают балластные белки кристаллическим сульфатом аммония (из расчета 500 г/л). На 200 мл экстракта добавляют 100 г сульфата аммония. Получают 230 мл фильтрата.

К полученному после первого высаливания прозрачному фильтрату при перемешивании 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 25 мл/л. Выпадает розовый осадок цитохрома C. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее осадок промывают раствором сульфата аммония из расчета 500 мл/кг сырья, центрифугируют, отделяют осадок. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде. Полученный раствор цитохрома замораживают. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома C переливают в целлофановый пакетик и ставят на сутки на диализ против физраствора. Выход цитохрома 0,1 г/кг исходного сырья.

Природный адсорбент перлит обрабатывают следующим образом: перлит отмывают дистиллированной водой до pH 6, затем замачивают в подкисленной серной кислотой до pH 5,8 воде и выдерживают при помешивании 1 ч. Перлит отжимают через бязь или капрон и добавляют в фарш.

Пример 2.

Берут 100 г фарша из сердец лососевых (вид Oncorhynchus nerca) со сроком хранения 4,5 месяца в морозильнике при t=-8^oC. Проводят экстракцию 2,5% ТХУ при pH 5,5 в течение 2 ч. В конце экстракции добавляют предварительно подготовленный, как и в примере 1, в количестве 25 г перлит марки Dicalite (США) и при перемешивании выдерживают 0,5 ч. Получают после фильтрации на нутч-фильтре 81 мл экстракта (pH 5,5).

К экстракту добавляют 10% гидроксида натрия до pH 7,3. Для осаждения белков в экстракт добавляют кристаллический сульфат аммония из расчета 450 г/л, перемешивают и выдерживают 30 мин. Фильтруют через бумажные фильтры. Объем полученного фильтрата 62 мл.

Из полученного фильтрата осаждают цитохром C 10% H₂SO₄, выпадает осадок цитохрома C, фильтруют, надосадочную жидкость сливают, а осадок обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугируют. Собранный осадок цитохрома C растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Замораживают при t-12^oC, размораживают и отфильтровывают для отделения криопреципитатных белков. Крепкий раствор цитохрома помещают в целлофановый пакетик, ставят на диализ против физраствора.

Выход цитохрома C от исходного сырья 0,090 г/кг исходного сырья.

Пример 3.

Берут 400 г свежих сердец лососевых (вид Oncorhynchus gorbuscha), промывают от крови, измельчают в фарш, еще раз промывают от крови. К приготовленному фаршу добавляют 2% H₂SO₄ до pH 4,9, t 23^oC. Выход на режим 20 мин. В течение 2 ч проводят экстракцию. По окончании в экстракционную массу добавляют обработанный по примеру 1 перлит марки Flo R (Франция) из расчета 300 г/кг сырья, оставляют на 30 мин для осаждения белков. Отделяют жмых от экстракта через бязь. Далее проводят нейтрализацию экстракта 10% NaOH до pH 7,15.

Проводят высаливание кристаллическим сульфатом аммония из расчета 450 г/л, на 280 мл фильтрата добавляют 126 г сульфата. После фильтрации объем фильтрата 335 мл.

Осаждают цитохром 20%-ной трихлоруксусной кислотой. К 330 мл фильтрата добавляют 6,6 трихлоруксусной кислоты из расчета 20 мл/л. Через 20-30 мин выпадает осадок цитохрома C. Отделяют его центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин и обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония до очистки от примесей. Собранный раствор в 1,7 мл дистиллированной воды. Полученный раствор цитохрома C замораживают при -12^oC. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома C переливают в целлофановый пакетик и ставят на сутки на диализ против физиологического раствора.

Выход цитохрома C 0,070 мг/кг сырья.

Способ получения цитохрома С включает экстракцию фарша из сердец лососевых трихлоруксусной или серной кислотами при pH 4,8-5,6, отделение балластных белков на природном адсорбенте - перлите, добавляемом к экстракционной массе из расчета 20-30 г на 100 г исходного сырья, отделение экстракта, его нейтрализацию до нейтрального pH, осаждение белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома С ТХУ или серной кислотой, промывку его насыщенным раствором сульфата аммония для отделения примесей, растворение в воде с последующим замораживанием - размораживанием, фильтрование, диализ, стерильную фильтрацию и расфасовку. Полученный цитохром С имеет наиболее приближенный аминокислотный состав к цитохрому С человека. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения цитохрома С путем экстракции измельченной сердечной мышцы животного, включающий осаждение балластных басков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома С кислотой, обработку осадка насыщенным раствором сульфата аммония с последующим растворением осадка, содержащего целевой продукт в дистиллированной воде, его замораживание, размораживание, фильтрование и диализ, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют сердце лососевых, экстракцию проводят при рН 4,8 5,5, а в конце экстракции в экстракционную смесь добавляют перлит в соотношении 20 30 г на 100 г исходного сырья. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию измельченной сердечной мышцы проводят 2,0 2,5%-ным раствором серной или трихлоруксусной кислоты. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что осаждение цитохрома С проводят 10 20%-ным раствором серной или трихлоруксусной кислоты.