СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ФАКТОР /G-CSF/, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РОСТ КОЛОНИЙ ГРАНУЛОЦИТОВ Российский патент 1994 года по МПК A61K9/14 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения препарата, содержащего фактор (G-CSF), стимулирующий рост колоний гранулоцитов (ФСКГ).

Целью изобретения является повышение стабильности.

Практируемая в настоящее время химиотерапия заключает в себе различные неизбежные проблемы, предпринимаются интенсивные усилия с тем, чтобы использовать лекарственное вещество, способное активировать профилактические функции хозяина или субъекта, который заражен.

ФСКГ проявляет способность активировать профилактические функции хозяина, кроме того, обнаружено, что ФСКГ показывает более высокие терапевтические эффекты в клинических применениях, если он используется в комбинации с веществом, которое активирует профилактические возможности хозяина.

ФСКГ используется в очень малом количестве, фармацевтический препарат, содержащий 0,1-500 мкг (предпочтительно 5-50) ФСКГ, обычно вводят с интенсивностью дозировки 1-7 раз в неделю на взрослого пациента. Однако ФСКГ имеет склонность адсорбироваться на стенке емкости, например ампула для инъекции или шприц. Следовательно, если лекарство используется в виде инъекции в виде водного раствора, оно будет адсорбироваться на стенке емкости, например ампула или шприц. Это приводит к неспособности ФСКГ полностью проявлять активность в качестве фармацевтического средства либо влечет за собой введение ФСКГ в более чем необходимом количестве, принимая во внимание его возможную потерю вследствие адсорбции.

Кроме того, ФСКГ является лабильным и чрезвычайно восприимчивым к окружающим факторам, например температура, влажность, кислород и фильтрафиолетовые лучи. Под действием таких факторов ФСКГ испытывает физические и химические изменения: сооциация, полимеризация и окисление - и терпит большие потери в активности. Эти явления затрудняет осуществление полного выполнения терапевтического действия введением очень малого количества ФСКГ строгим образом. Поэтому существует необходимость разработки устойчивого фармацевтического препарата ФСКГ, который полностью защищен от потери активности его эффективного компонента. Это является основной целью изобретения, которое предлагает устойчивый фармацевтический препарат ФСКГ.

В способе приведены интенсивные исследования с целью повышения устойчивости ФСКГ. Цель может быть эффективно достигнута при помощи прибавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, сахарида, протеина или высокомолекулярного соединения.

Следовательно, устойчивый фармацевтический препарат, содержащий ФСКГ, отличается содержанием ФСКГ и по крайней мере одного вещества, выбранного из группы фармацевтически приемлемых поверхностно-активного вещества, сахарида, протеина или высокомолекулярного соединения.

ФСКГ, содержащийся в фармацевтическом препарате настоящего изобретения, может быть получен любым из известных способов, которые описаны в патентах Японии NN 153273 (1984), 269455 (1985), 270838 (1985) и 270839 (1985).

Полученный раствор, содержащий ФСКГ, можно хранить в замороженном состоянии после дальнейшей его очистки и концентрации с использованием любой известной методики. Альтернативно раствор можно хранить после его дегидратации такими способами, как, например, лиофилизация.

Все полученные таким образом ФСКГ могут быть обработаны, чтобы получить устойчивые ФСКГсодержащие фрамацевтические препараты.

Типичные примеры поверхностно-активного вещества, которое используют для получения устойчивого ФСКГсодержащего фармацевтического препарата настоящего изобретения, перечислены ниже. Неионогенные поверхностно-активные вещества с Н1В 6-18, такие как сорбитановые сложные эфиры алифатической кислоты (например, сорбитанмонокаприлат, сорбитанмонолаурат и сорбитанмонопальмитет), глицериновые сложные эфиры алифатической кислоты (например, глицеринмонокаприлат, глицеринмономиристат и глицеринмоностеарат), полиглицериновые сложные эфиры алифатической кислоты (например, декаглицерилмоностеарат, декаглицерилдистеарат и декаглицерилмонолинолеат), полиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры алифатической кислоты (например, полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, полиоаксиэтиленсорбитанмоноолеат, полиоксиэтиленсорбитанмоностеарат, полиоксиэтиленсорбитанмонопальминат, полиоксиэтиленсорбитантриолеат и полиоксиэтиленсорбитантристеарат), полиоксиэтиленсорбитовые сложные эфиры алифатической кислоты (например, полиоксиэтиленсорбиттетрастеарат и полиоксиэтиленсорбиттетраолеат), полиоэтиленглицериновые сложные эфиры алифатической кислоты (например, полиоксиэтиленглицерилмоностеарат), полиэтиленгликолевые сложные эфиры алифатической кислоты (например, полиэтиленгликольдистеарат), полиоксиэтиленовые простые алкиловые эфиры (например, полиоксиэтиленлауриновый эфир), полиоксиэтиленполиоксипропиленовые простые алкиловые эфиры (например, полиоксиэтиленполиоксипропиленгликолевый эфир, полиоксиэтиленполиоксипропиленпропиловый эфир и полиоксиэтиленполиоксипропиленцетило- вый эфир), полиоксиэтиленовые простые алкилфеноловые эфиры (например, полиоксиэтиленнонилфениловый эфир), полиоксиэтилированное касторовое масло, полиоксиэтилированое отвержденное касторовое масло (полиоксиэтилированное гидрогенизированное касторовое масло), полиоксиэтилированные производные пчелиного воска (например, пчелиный воск полиоксиэтилированного сорбита), производные полиоксиэтиленланолина (например, полиоксиэтиленланолин) и полиоксиэтиленовые алифатические амиды (например, полиэтиленовый амид стеариновой кислоты). Анионогенные поверхностно-активные вещества, такие как соли алкилсерной кислоты, имеющие С₁₀-С₁₈-алкильную группу (например, цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия и олеилсульфат натрия), соли серной кислоты полиоксиэтиленового простого алкилового эфира, где среднее молярное число присоединения окиси этилена составляет 2-4 и алкильная группа содержит 10-18 атомов углерода (например, полиоксиэтиленовый лаурилсульфат натрия), соли алкиловых сложных эфиров сульфосукцината, где алкильная группа содержит 8-18 атомов углерода (например, сложный эфир лаурилсульфосукцината натрия). А также природные поверхностно-активные вещества, такие как лецитин, глицерофосфолипид, сфингофосфолипид (например, офингомиелин) и сложные эфиры алифатической кислоты сахарозы, где алифатическая кислота имеет 12-18 атомов углерода. Эти поверхностно-активные вещества, конечно, могут быть использованы либо самостоятельно, либо в смеси.

Поверхностно-активные вещества, приведенные выше, предпочтительно использовать в количествах 1-1000 мас.ч. на мас.ч. ФСКГ.

Сахарид, используемый при получении устойчивого ФСКГсодержащего фармацевтического препарата настоящего изобретения, может быть выбран из числа моносахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, а также сложных фосфатных эфиров и их нуклеотидных производных при условии, что они фармацевтически являются приемлемыми. Типичные примеры приведены ниже: трехатомные и высшие сахаридные спирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит, кислотные сахара, такие как глюкуроновая кислота, идуроновая кислота, нейраминовая кислота, галактуроновая кислота, глюконовая кислота, маннуроновая кислота, кетогликолевая кислота, кетогалактоновая кислота, кетогулоновая кислота, гиалуроновая кислота и ее соли, хондроитинсульфат и его соли, гепарин, инулин, хитин и его производные, хитозан и его производные, декстрин, декстран со средними м. мас. 5000-150000, альгиновая кислота и ее соли. Все эти сахариды могут быть использованы с преимуществом либо самостоятельно, либо в смеси.

Сахариды, приведенные выше, предпочтительно использовать в количествах 1-10000 мас.ч. на мас.ч. ФСКГ.

Типичными примерами протеина, используемого при получении устойчивого ФСКГсодержащего фармацевтического препарата настоящего изобретения, являются сывороточный альбумин человека, сывороточный глобулин человека, желатина, желатина, обработанная кислотой (средняя мол. м. 7000-100000), желатина, обработанная щелочью (средняя мол. м. 7000-100000), а также коллаген. Эти протеины могут быть использованы как самостоятельно, так и в смеси.

Указанные протеины предпочтительно использовать в количествах 1-20000 мас.ч. на мас.ч. ФСКГ. Типичные примеры высокомолекулярного соединения, используемого при получении устойчивого ФСКГсодержащего фармацевтического препарата настоящего изобретения, включают природные полимеры, такие как оксипропилцеллюлоза, оксиметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и оксиэтилцеллюлоза, а также синтетические полимеры, такие как полиэтиленгликоль (мол. м. 300-6000), поливиниловый спирт (мол. м. 20000-100000) и поливинилпирролидон (мол. м. 20000-100000). Эти высокомолекулярные соединения могут быть использованы и самостоятельно, и в комбинации.

Высокомолекулярные соединения, приведенные выше, желательно использовать в количествах 1-20000 мас.ч. на мас.ч. ФСКГ.

Чтобы составить устойчивый ФСКГсодержащий фармацевтический препарат настоящего изобретения в пригодной дозированной форме, могут быть введены один или более следующих агентов: разбавитель, растворяющее вспомогательное вещество, изотоническое вещество, инертный наполнитель, модификатор рН, мягчитель и буфер.

Стабилизированный ФСКГ фармацевтический препарат настоящего изобретения может быть приготовлен либо для перорального введения, либо для перентерального введения, например, путем инъекции, вводимой различными путями; большое разнообразие форм дозировки зависит от специфического режима введения. Типичные формы дозировки: для перорального введения, такие как таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и суспензии, растворы, суспензии и лиофилизированные препараты, предназначенные для внутренней инъекции, и для трансмукозного введения (через слизистую), такие как ректальные суппозитории, назальные лекарства и вагинальные супозитории.

В соответствии с настоящим изобретением по крайней мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества, сахарида, протеина или высокомолекулярного соединения, добавляют в ФСКГсодержащий фармацевтический препарат с тем, чтобы он был предохранен от адсорбирования на стенке его емкости или шприца и в то же время оставался устойчивым в течение продолжительного периода времени.

Подобный механизм, посредством которого указанные вещества стабилизируют ФСКГ или предохраняют его от адсорбирования, еще не известен. В присутствии поверхностно-активного вещества поверхность ФСКГ, представляющего собой гидрофобный протеин, была бы защищена поверхностно-активным веществом от того, чтобы быть растворенной, так что ФСКГ, присутствующий в следовых количествах, эффективно предохранен от адсорбирования на стенке его емкости или шприца. Сахарид или гидрофильное высокомолекулярное соединение могли бы образовать гидратированный слой между ФСКГ и адсорбирующей стенкой его емкости или шприца, тем самым эффективно предупреждая адсорбцию ФСКГ. Протеин мог бы конкурировать с ФСКГ из-за адсорбции на стенке его емкости или шприца, эффективно ингибируя адсорбцию ФСКГ.

Кроме предотвращения адсорбции ФСКГ, упомянутые вещества могли бы также способствовать предотвращению ассоциации или полимеризации молекул ФСКГ. В присутствии поверхностно-активного вещества, сахарида, протеина или высокомолекулярного соединения отдельные молекулы ФСКГ диспергируют в этих веществах и взаимодействие между молекулами ФСКГ значительно уменьшается, что вызывает значительное снижение вероятности их ассоциации или полимеризации. Кроме того, эти вещества могли бы затормозить самоокисление ФСКГ, которое ускоряется при высокой температуре или влажности, или предотвратить ассоциацию или полимеризацию ФСКГ в результате его самоокисления. Эти эффекты ингибирования самоокисления ФСКГ или предохранения его от ассоциации или полимеризации можно было бы усилить еще путем прибавления аминокислоты, серного восстановителя или антиокислителя.

Описанные проблемы достойны особого внимания при использовании растворов для инъекции и суспензий, однако они также встречаются во время процессов составления ФСКГ в любых дозировочных формах, например таблетки. Прибавление поверхностно-активных веществ, протеинов, сахаридов или высокомолекулярных соединений эффективно и в этом последнем случае.

Посредством прибавления по крайней мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества, сахарида, протеина или высокомолекулярного соединения, ФСКГ является высокостабилизированным и сохраняет свою активность в течение продолжительного периода времени. Для достижения этих результатов количество каждого из этих веществ, в особенности его нижний предел, является решающим, желательны следующие интервалы: 1-10000 мас. ч. поверхностно-активного вещества, 1-10000 мас.ч. сахарида, 1-20000 мас.ч. протеина и 1-20000 мас.ч. высокомолекулярного соединения на 1 мас.ч. ФСКГ.

В соответствии с изобретением поверхностно-активное вещество, сахарид, протеин и/или высокомолекулярное соединение используют в точно определенной концентрации, которая эффективна не только для предотвращения ФСКГ от адсорбирования на стенке емкости или шприца, но также в повышении устойчивости ФСКГсодержащего фармацевтического препарата. Как результат становится возможным гарантировать введение малой, однако чрезвычайно точной дозы ФСКГ пациентам, поскольку ФСКГ является дорогим препаратом, его эффективное использование приведет к более низким расходам на получение ФСКГсодержащих фармацевтических препаратов.

Следующие примеры предлагаются для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения. В этих примерах остаточная активность ФСКГ была определена одним из следующих способов.

(а). Метод мягкого агара с использованием клеток костного мозга мышей
Лошадиную сыворотку (0,4 мл), 0,1 мл пробы, 0,1 мл суспензии клеток костного мозга мышей (самки) СЗН (Не) 0,5-1 х 10⁵ ядерных клеток и 0,4 мл модифицированного культурального раствора МсСоy'S 5А, содержащего 0,75% агара, смешивают, выливают в пластмассовую чашку для тканевой культуры (диаметр 35 мм), коагулируют и культивируют в течение 5 дней при 37^оС в смеси 5% СО₂ и 95% воздуха при 100%-й влажности. Подсчитывают число образовавшихся колоний (одна колония состоит из по крайней мере 50 клеток), активность определяют из расчета одна единица соответствует активности для образования одной колонии.

Модифицированный культуральный раствор МсСоy'S 5А, используемый в методе (а), получают при помощи следующих методик.

Модифицированный культуральный раствор МсСоy'S 5А (двойная концентрация).

12 г культурального раствора МсСоy'S 5А (Gibco), 2,55 г МЕМ среды аминокислота-витамин (Nissui Seiyoku Co., Ltd), 2,18 г бикарбоната натрия и 50000 ед. калиевого пенициллина G растворяют дважды в 500 мл дистиллированной воды, раствор асептически фильтруют через миллипоровый фильтр (0,22 мкм).

(б). Жидкостная громатография высокого разрешения с обращенными фазами.

Используя колонку С8 с обращенными фазами (4,6 мм х 300 мм, 5 мкм) и смесь н-пропанол/трифторуксусная кислота в качестве подвижной фазы, определяют остаточную активность ФСКГ (введенного в количестве , эквивалентном 1 мкг) в следующих условиях градиента. емя Раствель (А) Расттель (В) Г Растворитель (А): 30%-й н-пропал и 0,1%-я трифторуксусная кислота. Растворитель (В): 60%-й н-пропанол и 0,1%-я трифторуксусная кислота. Определение проводят при длине волны 210 нм, процентное содержание остаточной активности ФСКГ вычисляют по следующей формуле:
= 100
Остаточное количество ФСКГ, определенное данным методом, очень хорошо согласуется с результатом, полученным при измерении методом мягкого агара (а) с использованием клеток костного мозга мышей.

П р и м е р 1. К 5 мкг ФСКГ прибавляют один из стабилизаторов, приведенных в табл. 1, смесь септически растворяют в 20 мМ буферном растворе, содеражащем 100 мМ хлористый натрий, рН 7,4, с получением фармацевтического препарата, содержащего 5 мкг ФСКГ на 1 мл, который затем лиофилизируют. Зависящее от времени изменение в активности ФСКГ измеряют методом (а), результаты приведены в табл. 1. Активность (%) обозначает остаточную активность ФСКГ относительно первоначальной единицы и определяется по следующей формуле:
Активность (%) = × 100 .

Лиофилизацию осуществляют следующим образом. Раствор ФСКГ, содержащий стабилизатор, помещают в стерильную сульфаобработанную стеклянную пробирку, замораживают при -40^оС или ниже в течение 4 ч, подвергают первичной сушке путем нагрева от -40^оС до 0^оС за 48 ч при повышении давления от 0,03 до 0,1 мм рт. ст. Затем подвергают вторичной сушке путем нагрева от 0 до 20^оС в течение 12 ч при повышении давления от 0,03 до 0,08 мм рт.ст., после чего внутренность пробирки наполняют стериальным сухим газообразным азотом для получения атмосферного давления и пробирку закупоривают лиофилизированной резиновой пробкой, а затем герметизируют алюминиевым колпачком.

П р и м е р 2. К 10 мкг ФСКГ прибавляют один из стабилизаторов, приведенных в табл. 2, смесь асептически растворяют в 20 мМ фосфатного буферного раствора, содержащего 100 мМ хлористый натрий, рН 7,4, с получением фармацевтического препарата, содержащего 10 мкг ФСКГ на 1 мл. Препарат асептически загружают в сульфаобработанную стеклянную пробирку и герметизируют с получением раствора ФСКГ. Зависящее от времени изменение в активности ФСКГ в данном растворе измеряют при помощи того же способа, который используют в примере 1, и результаты приведены в табл. 2.

П р и м е р 3. К 10 мкг прибавляют один из стабилизаторов (см. табл. 3), смесь асептически растворяют в 20 мМ растворе фосфатного буфера, содержащем 100 мМ хлористый натрий, рН 7,4, с получением фармацевтического препарата, содержащего 10 мкг ФСКГ на 1 мл. Один миллилитр препарата загружают в сульфаобработанную, покрытую кремнием стеклянную пробирку и оставляют при 4^оС. Эффективность каждого стабилизатора в предотвращении адсорбции ФСКГ вычисляют посредством измерения остаточной активности ФСКГ в растворе через 0,5, 2 и 24 ч. Измерение осуществляют методом (б) с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенными фазами. Результаты приведены в табл. 3.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения препарата, содержащего фактор (G - CSF), стимулирующего рост колоний грануляцитов. Цель - повышение стабильности. При получении препарата, содержащего фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, используется, кроме фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов, присутствующего в качестве эффективного компонента, по крайней мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, сахарида, протеина и высокомолекулярного соединения. 1 з. п. ф-лы, 3 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ФАКТОР /G-CSF/, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РОСТ КОЛОНИЙ ГРАНУЛОЦИТОВ, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности, смешивают G - CSF при температуре от 1 до 30^oС по меньшей мере с одним веществом, выбранным из группы, включающей фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество, сахарид, белок и высокомолекулярное соединение в соответствующих указанному порядку перечисления количествах: 1 - 10000 мас.ч., 1 - 10000 мас.ч., 1 - 20000 мас.ч. и 1 - 20000 мас. ч. на 1 ч. G - CSF, затем смесь растворяют в буферном растворе, при этом упомянутый фактор G - CSF обладает следующими физико-химическими свойствами: а) молекулярный вес около 19000 ± 1000, измеренный методом электрофореза через додецилсульфат натрия-полиакриламидный гель; б) изоэлектрическая точка: имеет по меньшей мере одну из трех изоэлектрических точек pI = 5,5 ± 0,1; pI = 5,8 ± 0,1 и pI = 6,1 ± 0,1; в) ультрафиолетовое поглощение: имеет максимальное поглощение при 280 нм и минимальное поглощение при 250 нм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что берут аминокислотную последовательность 21 остатка от N-терминала: H₂N - ThZ - Pro - Leu- Glu - Pzo - Ala - Ser - Ser - Leu - Fro - Zeh - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Zlu - Zbh - Val -, поверхностно-активное вещество выбрано из группы, содержащей сложный эфир сорбитана и алифатической кислоты, сложный эфир алифатической кислоты и полиоксиэтиленсорбитана, простой алкиловый эфир полиоксиэтиленполиоксипропилена, полиоксиэтилированное отвержденное касторовое масло, соль алкилсульфата и лецитин, сахарид выбран из группы, включающей глицерин, ксилит, маннит, глюкуроновую кислоту, неймариновую кислоту, кетогликолевую кислоту, гепарин, хитин, хитозан, декстрин и альгиновую кислоту, белок выбран из группы, включающей альбумин человеческой сыворотки, глобулин сыворотки человека, обработанный кислотой или щелочью желатин и коллаген, высокомолекулярное соединение выбрано из группы, включающей гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, полиэтиленгликоль и поливинилпирролидон, буферный раствор выбран из группы, включающей фосфатный буфер, ацетатный буфер и цитратофосфатный буфер.