АГЕНТЫ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ ОСТРОВКОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОСТРОВКОВ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/395 A61P3/10 

Область техники

Настоящее изобретение относится к агентам для подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островка, которые включают ингибиторы IL-6 в качестве активных ингредиентов, и к их применениям.

Предшествующий уровень техники

Инсулин представляет собой гипогликемический гормон. Причиной инсулинозависимого диабета является избирательное разрушение продуцирующих инсулин клеток (островковых β-клеток) благодаря иммунологическим механизмам, и известно, что его возникновение приводит к гипергликемии, вызывающей различные нарушения. При традиционном лечении вводят (инъецируют) препараты недопоставляемого инсулина для того, чтобы компенсировать нехватку инсулина с целью снижения гипергликемии. Однако при основанном на инсулине лечении строгая регуляция сахара в крови затруднена, что может привести к избыточному введению, которое может вызвать смертельную гипогликемию. После возникновения диабета прогрессируют диабетические сосудистые осложнения (такие как ретинопатия, нефропатия и нейропатия). Традиционные терапевтические способы, такие как инъекции инсулина, не могут остановить этот прогресс, что приводит к терапевтически серьезным проблемам. Уровень сахара в крови физиологически контролируется главным образом с помощью регуляторного механизма островковых β-клеток; однако при инсулинозависимом диабете делеция этих островков приводит к сильным подъемам и спадам уровня сахара в крови, что является причиной описанных выше клинических симптомов.

В последние годы в Европе и Соединенных Штатах началось клиническое применение трансплантации островков, при которой панкреатические островки Лангерганса (островки) трансплантируют в качестве средства лечения диабета. Таким образом, пытаются лечить не путем введения инсулина, а путем трансплантации продуцирующих инсулин клеток. Практической методикой клинической трансплантации островков является следующая методика: под местной анестезией осуществляют чрескожную, чрезлегочную катетеризацию воротной вены с ультразвуковым контролем направления, и затем островки донора трансплантируют в печень через катетер. Трансплантаты островков приживаются в конце воротной вены и регулируют уровень сахара в крови путем секреции инсулина. При успешной трансплантации островков она восстанавливает нормальный уровень сахара в крови реципиентов, страдающих диабетом, так что отпадает необходимость лечить инсулином. Однако на сегодняшний день успешные случаи клинической трансплантации островков ограничены. Кроме того, для трансплантации одному реципиенту требуются островки, выделенные из поджелудочных желез двух или трех доноров. В частности, поскольку нарушения функции островков, которые возникают немедленно после трансплантации, уменьшают жизнеспособность трансплантатов, трансплантация островков от одного донора одному реципиенту является недостаточной, и, таким образом, осуществляют трансплантацию от двух или трех доноров одному реципиенту. В некоторых сообщениях говорится только о 20-30% выживаемости трансплантированных трансплантатов. Детали этих функциональных нарушений остаются неясными, но они являются причиной чрезвычайно серьезной проблемы в улучшении результатов клинической трансплантации островков.

Обычно трансплантацию островков осуществляли с использованием островков, выделенных из поджелудочных желез доноров после смерти их головного мозга или доноров с остановкой сердца. В недавних сообщениях также описываются успешные случаи трансплантации островков от живых доноров, при которых островки выделяют и очищают из части поджелудочной железы, иссеченной у здоровых доноров, и трансплантируют больным диабетом. Такая трансплантация островков живых доноров является инвазивной и тяжелой для доноров. Таким образом, предпочтительно сделать возможным лечение, которое подавляет повреждение трансплантированных островков сразу после трансплантации и при котором используется меньшее число островков доноров.

IL-6 является цитокином, называемым стимулирующим В-клетки фактором 2 (BSF2), или интерфероном β2. IL-6 был обнаружен как фактор дифференциации, вовлеченный в активацию В-лимфоцитов (непатентный документ 1), и, как позже обнаружилось, является многофункциональным цитокином, оказывающим влияние на функцию различных клеток (непатентный документ 2). Сообщалось, что IL-6 индуцирует созревание Т-лимфоцитов (непатентный документ 3).

IL-6 передает свою биологическую активность через два вида белков в клетку. Один из белков представляет собой рецептор IL-6, являющийся связывающим лиганд белком, с которым связывается IL-6, и имеет молекулярную массу, составляющую приблизительно 80 кДа (непатентные документы 4 и 5). Помимо связанной с мембраной формы, которая пронизывает и экспрессируется на клеточной мембране, рецептор IL-6 присутствует в виде растворимого рецептора IL-6, который главным образом состоит из внеклеточной области связанной с мембраной формы.

Другим белком является мембранный белок gp130, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 130 кДа, и вовлеченный в нелигандную передачу сигнала связывания. Биологическая активность IL-6 передается в клетки благодаря образованию IL-6 и рецептором IL-6 комплекса IL-6/рецептор IL-6 и после этого связыванию комплекса с gp130 (непатентный документ 6).

Ингибиторы IL-6 являются веществами, ингибирующими передачу биологической активности IL-6. К настоящему времени известны антитела против IL-6, антитела против рецептора IL-6, антитела против gp130, варианты IL-6, частичные пептиды IL-6 или рецепторы IL-6.

Имеется несколько сообщений, касающихся антител против рецепторов IL-6 (непатентные документы 7 и 8, патентные документы 1-3). Известно (патентный документ 4) гуманизированное антитело РМ-1, полученное трансплантацией в антитело человека определяющего комплементарность области (CDR) антитела РМ-1 мыши (непатентный документ 9), которое является одним из антител против рецептора IL-6.

Ниже представлена информация о документах предшествующего уровня техники, относящихся к настоящему изобретению:

[Непатентный документ 1] Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76;

[Непатентный документ 2] Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78;

[Непатентный документ 3] Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258;

[Непатентный документ 4] Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981;

[Непатентный документ 5] Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828;

[Непатентный документ 6] Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581;

[Непатентный документ 7] Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146;

[Непатентный документ 8] Huang, Y.W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630;

[Непатентный документ 9] Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906;

[Патентный документ 1] публикация международной заявки на патент № WO 95/09873;

[Патентный документ 2] заявка на патент Франции № FR 2694767;

[Патентный документ 3] патент США № 5216128;

[Патентный документ 4] WO 92/19759.

Раскрытие изобретения

[Проблемы, решаемые настоящим изобретением]

При трансплантации островков для лечения диабета важно увеличить жизнеспособность островков с помощью подавления повреждения трансплантированных островков во время трансплантации. Однако на сегодняшний день нет эффективных способов. Кроме того, не было предшествующей оценки того, демонстрирует ли антитело против рецептора IL-6, являющееся ингибитором IL-6, эффект подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островков.

Настоящее изобретение было создано ввиду вышеуказанных предпосылок и нацелено на обеспечение агентов для подавления повреждения трансплантированных островков, которые включают ингибиторы IL-6 в качестве активных ингредиентов и используются при трансплантации островков. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способов подавления повреждения островков, трансплантированных субъектам, которые включают стадию введения субъектам ингибиторов IL-6.

[Способ решения проблем]

Для достижения описанных выше целей авторы настоящего изобретения проверили, вызывают ли антитела против рецептора IL-6 эффект подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островков.

Сначала авторы настоящего изобретения приготовили в качестве реципиентов страдающих диабетом мышей с помощью внутривенного введения стрептозотоцина самцам мышей С57BL/6.

Затем мышам-реципиентам, страдающим диабетом, трансплантировали островки, выделенные из поджелудочных желез двух мышей (400 островков) или от одной мыши (200 островков). Результаты показывают, что трансплантация островков поджелудочных желез двух мышей восстанавливает нормальные уровни сахара в крови и, следовательно, демонстрирует терапевтический эффект в отношении диабета, в то время как трансплантация островков поджелудочной железы одной мыши не восстанавливает нормальные уровни сахара в крови, и гипергликемическое состояние сохраняется (фиг. 2 и 3).

Между тем, когда внутрибрюшинно вводили 500 мкг антитела против рецептора IL-6 (MR16-1) трижды после трансплантации островков одной мыши (200 островков), нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у всех реципиентов после трансплантации (фиг. 4). Альтернативно, когда один раз вводили равную дозу антитела против рецептора IL-6, нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у ¾ реципиентов (фиг. 5). Когда один раз вводили 200 мкг антитела против рецептора IL-6, нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у 1/3 реципиентов (фиг. 6).

Также обнаружено, что введение антител против рецептора IL-6 по настоящему изобретению подавляет продукцию воспалительных цитокинов в инфильтрующих клетках после трансплантации.

Вышеуказанные обнаруженные факты демонстрируют, что антитела против рецептора IL-6 уменьшают повреждение трансплантированных островков, увеличивают жизнеспособность островков и корректируют гипергликемию у реципиентов.

В частности, авторами настоящего изобретения впервые обнаружено, что повреждение трансплантированных островков после трансплантации островков можно подавить, используя антитела против рецептора IL-6 в соответствии с настоящим изобретением, и, таким образом, они завершили настоящее изобретение.

Более конкретно, настоящим изобретением обеспечиваются следующие пункты [1]-[23]:

[1] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка после трансплантации островка, который включает ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента;

[2] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка, в соответствии с п. [1], в котором ингибитором IL-6 является антитело, которое распознает IL-6;

[3] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка в соответствии с п. [1], в котором ингибитором IL-6 является антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[4] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка в соответствии с п. [2] или [3], в котором антителом является моноклональное антитело;

[5] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка в соответствии с любым из п.п. [2]-[4], в котором антителом является антитело против IL-6 человека или антитело против рецептора IL-6 человека;

[6] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка в соответствии с любым из п.п. [2]-[5], в котором антителом является рекомбинантное антитело;

[7] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка в соответствии с п. [6], в котором антителом является химерное, гуманизированное антитело или антитело человека;

[8] Агент для подавления повреждения трансплантированного островка в соответствии с любым из п.п. [1]-[7], используемый для лечения диабета;

[9] Способ подавления повреждения трансплантированных островков у субъекта с трансплантацией островков, который включает стадию введения субъекту ингибитора IL-6;

[10] Способ увеличения жизнеспособности островка у субъекта с трансплантацией островка, который включает стадию введения субъекту ингибитора IL-6;

[11] Способ в соответствии с п. [9] или [10], в котором ингибитором IL-6 является антитело, которое распознает IL-6;

[12] Способ в соответствии с п. [9] или [10], в котором ингибитором IL-6 является антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[13] Способ в соответствии с п. [11] или [12], в котором антителом является моноклональное антитело;

[14] Способ в соответствии с любым из п.п. [11]-[13], в котором антителом является антитело против IL-6 человека или антитело против рецептора IL-6 человека;

[15] Способ в соответствии с любым из п.п. [11]-[14], в котором антителом является рекомбинантное антитело;

[16] Способ в соответствии с п. [15], в котором антителом является химерное, гуманизированное антитело или антитело человека;

[17] Применение ингибитора IL-6 для получения агентов для подавления повреждения трансплантированного островка после трансплантации островка;

[18] Применение в соответствии с п. [17], при котором ингибитором IL-6 является антитело, которое распознает IL-6;

[19] Применение в соответствии с п. [17], при котором ингибитором IL-6 является антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[20] Применение в соответствии с п. [18] или [19], при котором антителом является моноклональное антитело;

[21] Применение в соответствии с любым из п.п. [18]-[20], при котором антителом является антитело против IL-6 человека или антитело против рецептора IL-6 человека;

[22] Применение в соответствии с любым из п.п. [18]-[21], при котором антителом является рекомбинантное антитело; и

[23] Применение в соответствии с п. [22], при котором антителом является химерное, гуманизированное антитело или антитело человека.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые не подвергались трансплантации островков.

Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись изогенной трансплантации островков из поджелудочных желез двух мышей (400 островков).

Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись изогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков).

Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись изогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков) и которым внутрибрюшинно вводили трижды 500 мкг антитела против рецептора IL-6 после трансплантации.

Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись изогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков) и которым внутрибрюшинно вводили однократно 500 мкг антитела против рецептора IL-6 после трансплантации.

Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись изогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков) и которым внутрибрюшинно вводили однократно 200 мкг антитела против рецептора IL-6 после трансплантации.

Фиг. 7 представляет собой график, демонстрирующий, что введение антитела против рецептора IL-6 подавляет продукцию после трансплантации воспалительных цитокинов инфильтрующими клетками.

Фиг. 8 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись аллогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков) и которым внутрибрюшинно вводили трижды 200 мкг IgG крысы после трансплантации.

Фиг. 9 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись аллогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков) и которым внутрибрюшинно вводили однократно 200 мкг антитела против CD4 после трансплантации.

Фиг. 10 представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней сахара в крови мышей-реципиентов, страдающих диабетом, которые подверглись аллогенной трансплантации островков из поджелудочной железы одной мыши (200 островков) и которым внутрибрюшинно вводили трижды 500 мкг антитела против рецептора IL-6 и один раз 200 мкг антитела против CD4 после трансплантации.

Лучший вариант осуществления изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитело против рецептора IL-6 может подавлять повреждение трансплантированных островков после трансплантации островков. Настоящее изобретение основано на этом обнаружении.

Настоящее изобретение относится к агентам для подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островков, которые включают ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента.

Здесь «ингибитор IL-6» представляет собой вещество, блокирующее опосредуемую IL-6 передачу сигнала и ингибирующее биологическую активность IL-6. Предпочтительно ингибитором IL-6 является вещество, имеющее ингибиторную в отношении связывания IL-6, рецептора IL-6 или gp130 функцию.

Ингибиторы IL-6 по настоящему изобретению включают, но без ограничения, например, антитела против IL-6, антитела против рецептора IL-6, антитела против gp130, варианты IL-6, варианты растворимого рецептора IL-6 и частичные пептиды IL-6 или рецепторов IL-6 и низкомолекулярные соединения, демонстрирующие схожие активности. Предпочтительные ингибиторы IL-6 по настоящему изобретению включают антитела, которые распознают рецепторы IL-6.

В настоящем изобретении источник антитела особенно не ограничен, однако предпочтительно антитело является происходящим от млекопитающих, и более предпочтительно оно происходит от человека.

Используемое в настоящем изобретении антитело против IL-6 можно получить в виде поликлонального или моноклонального антитела с помощью известного способа. В частности, в качестве используемого в настоящем изобретении антитела против IL-6 предпочтительными являются моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих, включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые хозяевами, трансформированными экспрессирующим вектором, включающим ген антитела, с использованием методов генной инженерии. При связывании с IL-6 антитело ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Такие антитела включают MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956), антитело SK2 (Sato, K. et al., сообщение 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21, 166) и т.д.

В сущности, гибридомы, продуцирующие антитела против IL-6, можно получить с использованием известных методов следующим образом. В частности, такие гибридомы можно получить, используя IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации с помощью традиционного способа иммунизации, осуществляя слияние полученных иммунных клеток с известными исходными клетками с помощью традиционного способа слияния клеток и скринируя продуцирующие моноклональные антитела клетки с помощью традиционного способа скрининга.

Более конкретно, антитела против IL-6 можно получить следующим образом. Например, IL-6 человека, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген IL-6 и/или аминокислотные последовательности, раскрытые в Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541; и/или Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, в которую встроена последовательность гена IL-6, желаемый белок IL-6 очищают с помощью известного способа от внутреннего содержимого клетки-хозяина или от супернатанта в культуре клеток. Этот очищенный белок IL-6 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок IL-6 и другого белка.

Используемые для настоящего изобретения антитела против рецептора IL-6 можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известных способов. В частности, используемыми в настоящем изобретении антителами против рецептора IL-6 предпочтительно являются моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих, включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые хозяевами, трансформированными экспрессирующим вектором, включающим ген антитела, с использованием методов генной инженерии. При связывании с рецептором IL-6 антитело ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Такие антитела включают антитело MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), антитело PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906); антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 и антитело AUK146-15 (WO 92/19759); и т.д. Среди них в качестве примера предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 человека можно привести антитело РМ-1, а качестве примера предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 мыши - антитело MR16-1.

В сущности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против рецептора IL-6, можно получить с использованием известных методов следующим образом. В частности, такие гибридомы можно получить, используя рецептор IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации с помощью традиционного способа иммунизации, осуществляя слияние полученных иммунных клеток с известной исходной клеткой с помощью традиционного способа слияния клеток и скринируя продуцирующие моноклональное антитело клетки с помощью традиционного способа скрининга.

Более конкретно, антитела против рецептора IL-6 можно получить следующим образом. Например, рецептор IL-6 человека или рецептор IL-6 мыши, используемые в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя гены рецепторов IL-6 и/или аминокислотные последовательности, раскрытые в публикации заявки на европейский патент № ЕР 325474 и публикации Kokai заявки на патент Японии № (JP-A) H03-155795 (не рассмотренной, опубликованной заявки на патент Японии), соответственно.

Существуют два вида белков рецепторов IL-6, т.е. белок, экспрессируемый на клеточной мембране, и белок, отделенный от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Растворимый рецептор IL-6 состоит по существу из внеклеточной области связанного с клеточной мембраной рецептора IL-6 и отличается от связанного с мембраной рецептора IL-6 тем, что в нем отсутствует трансмембранная область или как трансмембранная, так и внутриклеточная области. В качестве белка рецептора IL-6 можно использовать любой рецептор IL-6 при условии, что его можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для продукции антитела против рецептора IL-6, используемого в настоящем изобретении.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, в которую встроена последовательность гена рецептора IL-6, желаемый белок рецептора IL-6 очищают с помощью известного способа от внутреннего содержимого клетки-хозяина или от супернатанта в культуре клеток. Этот очищенный белок рецептора IL-6 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетку, экспрессирующую рецептор IL-6, или слитый белок рецептора IL-6 и другого белка.

Используемые в настоящем изобретении антитела против gp130 можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известных способов. В частности, используемыми в настоящем изобретении антителами против gp130 предпочтительно являются моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих, включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые хозяевами, трансформированными экспрессирующим вектором, включающим ген антитела, с использованием методов генной инженерии. При связывании с gp130 антитело ингибирует связывание gp130 с комплексом IL-6/рецептор IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Такие антитела включают антитело AM64 (JP-A (Kokai) H03-219894); антитело 4B11 и антитело 2Н4 (US 5571513); антитело B-S12 и антитело В-Р8 (JP-A (Kokai) H08-291199) и т.д.

В сущности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против gp130, можно получить с использованием известных методов следующим образом. В частности, такие гибридомы можно получить, используя gp130 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации с помощью традиционного способа иммунизации, осуществляя слияние полученных иммунных клеток с известной исходной клеткой с помощью традиционного способа слияния клеток и скринируя продуцирующие моноклональное антитело клетки с помощью традиционного способа скрининга.

Более конкретно, моноклональное антитело можно получить следующим образом. Например, gp130, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген gp130 и/или аминокислотную последовательность, раскрытые в публикации заявки на Европейский патент № ЕР 411946.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, в которую встроена последовательность гена gp130, желаемый белок gp130 очищают с помощью известного способа от внутреннего содержимого клетки-хозяина или супернатанта в культуре клеток. Этот очищенный белок gp130 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетку, экспрессирующую gp130, или слитый белок gp130 и другого белка.

Иммунизируемые сенсибилизирующим антигеном млекопитающие особенно не ограничены, но их предпочтительно выбирают, принимая во внимание совместимость с исходной клеткой, используемой для слияния клеток. Обычно используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомячки.

Иммунизацию животных сенсибилизирующим антигеном проводят в соответствии с известными способами. Например, в качестве общего способа осуществляют инъекцию млекопитающим сенсибилизирующего антигена внутрибрюшинно или подкожно. В частности, сенсибилизирующий антиген предпочтительно разводят или суспендируют в соответствующем количестве забуференного фосфатом солевого раствора (PBS), физиологического раствора или такового, смешанного с соответствующим количеством общего адъюванта (например, полного адъюванта Фрейнда), превращают в эмульсию и затем вводят млекопитающему несколько раз каждые 4-21 день. Кроме того, для иммунизации сенсибилизирующим агентом можно использовать соответствующий носитель.

После такой иммунизации подтверждают возросший уровень желаемого антитела в сыворотке и затем от млекопитающего получают иммунные клетки для слияния клеток. Предпочтительные иммунные клетки для слияния клеток включают, в частности, клетки селезенки.

Для миеломных клеток млекопитающего, используемых в качестве исходной клетки, т.е. клетки-партнера, сливаемой с вышеуказанными иммунными клетками, соответствующим образом используют различные известные линии клеток, например, P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) и т.п.

В сущности, слияние упоминаемой выше иммунной клетки и миеломной клетки можно осуществить, используя известные способы, например способ Milstein и др. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) и т.п.

Более конкретно, упоминаемое выше слияние клеток выполняют в общей питательной культуральной среде в присутствии усиливающего слияние клеток агента. Например, в качестве усиливающего слияние клеток агента используют полиэтиленгликоль (PEG), вирус Сендай (HVJ) и т.п. Кроме того, для увеличения эффективности слияния можно добавить для использования в соответствии с потребностями вспомогательные агенты, такие как диметилсульфоксид.

Используемое соотношение иммунных клеток и миеломных клеток составляет предпочтительно, например, 1-10 иммунных клеток на каждую миеломную клетку. Культуральной средой, используемой для упоминаемого выше слияния клеток, является, например, культуральная среда RPMI1640 или MEM, которые подходят для пролиферации упоминаемых выше миеломных клеток. Можно также использовать общую культуральную среду, используемую для культивирования этого типа клетки. Кроме того, в комбинации можно использовать дополнения сывороткой, такой как фетальная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток представляющие интерес клетки слияния (гибридомы) образуют с помощью хорошего смешивания заранее определенных количеств упоминаемых выше иммунной клетки и миеломной клетки в упоминаемой выше культуральной среде и последующего добавления и смешивания раствора PEG (например, раствора PEG со средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 1000-6000), предварительно нагретого до приблизительно 37°С, в концентрации 30-60% (вес/объем). Затем удаляют агенты для слияния клеток и т.п., которые не подходят для роста гибридомы, с помощью повторения стадий последовательного добавления соответствующей культуральной среды и удаления супернатанта с использованием центрифугирования.

Вышеуказанные гибридомы отбирают с помощью культивирования клеток в общей культуральной среде для отбора, например, культуральной среде НАТ (культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в культуральной среде НАТ продолжают в течение достаточного периода времени, обычно в течение от нескольких дней до нескольких недель, для уничтожения клеток, отличных от представляющих интерес гибридом (неслившихся клеток). Затем осуществляют стандартный метод серийных разведений для скрининга и клонирования гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело.

Помимо способа иммунизации не являющегося человеком животного антигеном для получения упоминаемых выше гибридом, желаемое антитело человека, обладающее активностью связываться с желаемым антигеном или экспрессирующей антиген клеткой, можно получить с помощью сенсибилизации лимфоцита человека желаемым белком-антигеном или экспрессирующей антиген клеткой in vitro и слияния сенсибилизированного В-лимфоцита с миеломной клеткой человека (например, U266) (см. публикацию Kokoku заявки на патент Японии № (JP-B) H01-59878 (рассмотренную, одобренную заявку на патент Японии, опубликованную для опротестования)). Кроме того, желаемое антитело человека можно получить с помощью введения антигена или экспрессирующей антиген клетки трансгенному животному, имеющему набор генов антител человека, и затем следования упоминаемому выше способу (см. публикации международных заявок на патенты № WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Приготовленные таким образом гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, можно субкультивировать в традиционной культуральной среде и хранить в жидком азоте в течение длительного периода.

Для получения моноклональных антител из упоминаемых выше гибридом можно использовать следующие способы: (1) способ, в котором гибридомы культивируют в соответствии с традиционными способами, а антитела получают в виде супернатанта в культуре клеток; (2) способ, в котором гибридомы пролиферируют при введении их в совместимого млекопитающего, а антитела получают в виде асцитов; и т.д. Первый из двух названных способов является предпочтительным при получении антител высокой степени чистоты, а второй из двух названных способов является предпочтительным при высокомасштабном получении антител.

Например, получение продуцирующих антитело против рецептора IL-6 гибридом можно осуществить способом, раскрытым в JP-A (Kokai) H03-139293. Получение можно осуществить способом инъецирования продуцирующей антитело РМ-1 гибридомы в брюшную полость мыши BALB/c, получения асцита и затем очистки антитела РМ-1 из асцита или способом культивирования гибридомы в соответствующей среде (например, среде RPMI1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 5% BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); среде для гибридом SFM (GIBCO-BRL); среде PFHM-II (GIBCO-BRL) и т.д.) и затем получения антитела РМ-1 из супернатанта в культуре клеток.

В качестве моноклонального антитела по настоящему изобретению можно использовать рекомбинантное антитело, получаемое благодаря методам генетической рекомбинации путем клонирования гена антитела из гибридомы, встраивания гена в соответствующий вектор и затем введения вектора в хозяина (см., например, Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, документ, опубликованный в Соединенном Королевстве MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).

Более конкретно, мРНК, кодирующую вариабельную (V) область антитела, выделяют из клетки, продуцирующей представляющее интерес антитело, такой как гибридома. Выделение мРНК можно осуществить путем приготовления общей РНК согласно известным способам, таким как способ ультрацентрифугирования в гуанидине (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) и способ AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), и приготовления мРНК с использованием набора для очистки мРНК (Pharmacia) и т.п. Альтернативно, мРНК можно непосредственно приготовить, используя набор для очистки мРНК QuickPrep (Pharmacia).

С использованием полученной мРНК синтезируют кДНК V-области антитела, используя обратную транскриптазу. Синтез кДНК можно выполнить, используя набор для синтеза первой цепи кДНК с помощью обратной транскриптазы AMV, и т.д. Кроме того, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать 5'-RACE-способ (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), используя набор 5'-Ampli FINDER RACE-kit (Clontech), и ПЦР. Представляющий интерес фрагмент ДНК очищают из полученных ПЦР-продуктов и затем лигируют с векторной ДНК. Затем, используя вышеуказанную ДНК, готовят рекомбинантный вектор и вводят его в Escherichia coli или т.п, и отбирают колонии для получения желаемого рекомбинантного вектора. Нуклеотидную последовательность представляющей интерес ДНК подтверждают, например, дидезокси-методом.

Когда получают ДНК, кодирующую V-область представляющего интерес антитела, ее лигируют с ДНК, кодирующей константную область (С-область) желаемого антитела, и встраивают в экспрессирующий вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно встроить в экспрессирующий вектор, включающий ДНК С-области антитела.

Для получения антитела, используемого в настоящем изобретении, как описано ниже, ген антитела встраивают в экспрессирующий вектор так, чтобы он экспрессировался под контролем регулирующей экспрессию области, например, энхансера и промотора. Затем антитело можно экспрессировать трансформированием клетки-хозяина этим экспрессирующим вектором.

В настоящем изобретении для уменьшения гетероантигенности в отношении человека и т.п. можно использовать искусственно модифицированные генетические рекомбинатные антитела, например химерные антитела, гуманизированные антитела или антитела человека. Эти модифицированные антитела можно приготовить, используя известные способы.

Химерное антитело можно получить лигированием кодирующей V-область антитела ДНК, полученной, как указано выше, с кодирующей С-область антитела человека ДНК, встраиванием ДНК в экспрессирующий вектор и введением его в хозяина для продуцирования (см. публикацию заявки на европейский патент № ЕР 125023; публикацию международной заявки на патент № WO 92/19759). Этот известный способ можно использовать для получения химерных антител, используемых для настоящего изобретения.

На гуманизированные антитела также приводится ссылка в виде реконструированных антител человека, и они представляют собой антитела, в которых определяющие комплементарность области (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека, (например, антитела мыши) переносят в CDR антитела человека. Общие способы этой рекомбинации генов также известны (см. публикацию заявки на европейский патент № ЕР 125023; публикацию международной заявки на патент № WO 92/19759).

Более конкретно, последовательность ДНК, сконструированную так, чтобы CDR антитела мыши были лигированы с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных так, чтобы они содержали перекрывающиеся части на своих концах. Полученную ДНК лигируют с кодирующей С-область антитела человека ДНК и затем встраивают в экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вводят в хозяина для продуцирования гуманизированного антитела (см. публикацию заявки на европейский патент № ЕР 239400; публикацию международной заявки на патент № WO 92/19759).

FR антитела человека, лигируемые через CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывали подходящий сайт связывания антигена. Аминокислоту(ы) в пределах FR вариабельных областей антитела можно заместить при необходимости так, чтобы CDR реконструированного антитела человека образовали подходящий сайт связывания антигена (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

С-области антитела человека используют для химерных и гуманизированных антител и включают Сγ. Например, можно использовать Сγ1, Сγ2, Сγ3 или Сγ4. Кроме того, для увеличения стабильности антитела или его продукции С-области антитела человека можно модифицировать.

Химерные антитела состоят из вариабельной области антитела, происходящего из не являющихся человеком млекопитающих, и С-области, происходящей из антитела человека; а гуманизированные антитела состоят из CDR антитела, происходящего из не являющихся человеком млекопитающих, каркасных областей и С-областей, происходящих из антитела человека. Оба антитела имеют уменьшенную антигенность в организме человека и, следовательно, применимы в качестве антител, используемых в настоящем изобретении.

Предпочтительные конкретные примеры гуманизированных антител, используемых в настоящем изобретении, включают гуманизированное антитело РМ-1 (см. публикацию международной заявки на патент № WO 92/19759).

Кроме того, помимо упоминаемого выше способа получения антитела человека также известны методы получения антител человека с помощью пэннинга с использованием библиотеки антител человека. Например, можно экспрессировать вариабельные области антител человека на поверхности фагов в виде одноцепочечных антител (scFv) с помощью метода фагового дисплея и затем отобрать связывающие антиген фаги. Путем анализа генов отобранных фагов можно определить ДНК-последовательности, кодирующие вариабельные области антитела человека, с которыми связывается антиген. После обнаружения ДНК-последовательности scFv, которая связывается с антигеном, для получения антитела человека можно сконструировать соответствующий экспрессирующий вектор, включающий эту последовательность. Эти способы уже известны, и в качестве ссылки можно использовать публикации WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388.

Ген сконструированного выше антитела можно экспрессировать в соответствии с традиционными способами. При использовании клетки млекопитающего ген антитела можно экспрессировать, используя ДНК, в которой экспрессируемый ген антитела функционально лигирован с пригодным обычно используемым промотором и сигналом поли-А, расположенным в 3' направлении от гена антитела, или вектор, включающий эту ДНК. Примеры промотора/энхансера включают наиболее ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.

Кроме того, другие промоторы/энхансеры, которые можно использовать для экспрессии антитела, используемого в настоящем изобретении, включают вирусные промоторы/энхансеры из ретровируса, полиомавируса, аденовируса, обезьяньего вируса 40 (SV40) и т.п.; и происходящие из клеток млекопитающих промоторы/энхансеры, такие как фактор элонгации 1α человека (HEF1α).

Например, при использовании промотора/энхансера SV40 экспрессию можно легко осуществить, следуя способу Mulligan и др. (Mulligan, R.C. et al., Nature (1979) 277, 108-114). Альтернативно, в случае промотора/энхансера HEF1α можно использовать способ Mizushima и др. (Mizushima, S. and Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

При использовании E.coli ген антитела можно экспрессировать с помощью функционального лигирования традиционного пригодного промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и экспрессируемого гена антитела. Примеры промоторов включают промотор lacZ, промотор araB и т.п. При использовании промотора lacZ экспрессию можно осуществить в соответствии со способом Ward и др. (Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), а промотор araB можно использовать в соответствии со способом Better и др. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).

При продукции антитела в периплазму E.coli можно использовать сигнальную последовательность pel B (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела. Продуцируемое в периплазму антитело выделяют и затем используют после соответствующей повторной укладки структуры антитела (см., например, WO 96/30394).

В качестве начала репликации можно использовать начала репликации, происходящие из SV40, полиомавируса, аденовируса, бычьего папилломавируса (BPV) и т.п. Кроме того, для увеличения числа копий генов в системе клеток-хозяев экспрессирующий вектор может включать ген аминогликозид-фосфотрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы E.coli (Ecogpt), ген дигидрофолат-редуктазы (dhfr) и т.п. в качестве селективного маркера.

Для приготовления антител, используемых в настоящем изобретении, можно использовать любую систему продуцирования. Системы продуцирования для приготовления антител включают системы продуцирования in vitro и in vivo. In vitro системы продуцирования включают системы продуцирования, в которых используются эукариотические клетки или прокариотические клетки.

Системы продуцирования, в которых используются эукариотические клетки, включают системы продуцирования, в которых используются клетки животных, клетки растений или клетки грибов. Такие клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, например, CHO, COS, миеломы, почки детеныша хомячка (ВНК), HeLa, Vero и т.п.; (2) клетки земноводных, например, ооцит Xenopus; и (3) клетки насекомых, например, sf9, sf21, Tn5 и т.п. Известные клетки растений включают клетки, происходящие из Nicotiana tabacum, которые можно культивировать в виде каллюса. Известные клетки грибов включают дрожжи, такие как Saccharomyces (например, S.cerevisiae), плесневые грибы, такие как Aspergillus (например, A.niger) и т.п.

Системы продуцирования, в которых используются прокариотические клетки, включают системы продуцирования, в которых используются бактериальные клетки. Известные бактериальные клетки включают E.coli и Bacillus subtilis.

Антитела можно получить введением представляющего интерес гена антитела в эти клетки с помощью трансформации и культивированием трансформированных клеток in vitro. Культивирование проводят в соответствии с известными способами. Например, можно использовать в качестве культуральной среды DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM и в комбинации дополнения сывороткой, такой как FCS. Кроме того, клетку, в которую введен ген антитела, можно перенести в брюшную полость или т.п. животного для продуцирования антитела in vivo.

С другой стороны, in vivo системы продуцирования включают системы продуцирования, в которых используются животные или растения. Системы продуцирования, в которых используются животные, включают системы продуцирования, в которых используются млекопитающие или насекомые.

Млекопитающие, которых можно использовать, включают коз, свиней, овец, мышей, быков и т.п. (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Кроме того, насекомые, которых можно использовать, включают тутовых шелкопрядов. При использовании растений можно использовать, например, табак.

Ген антитела вводят в этих животных или растения, и антитело продуцируется в организме животного или растениях и затем его извлекают. Например, ген антитела готовят в виде слитого гена путем встраивания гена в середину гена, кодирующего белок, такой как β-казеин козы, который уникальным образом продуцируется в молоко. ДНК-фрагмент, включающий слитый ген со встроенным геном антитела, инъецируют в эмбрион козы, а эмбрион вводят самке козы. Желаемое антитело получают из молока, продуцируемого трансгенным животным, рожденным от козы, которая получила эмбрион, или продуцируемого потомством животного. Для увеличения количества продуцируемого трансгенной козой молока, содержащего желаемое антитело, можно соответствующим образом использовать для трансгенной козы гормоны (Ebert, K.M. et al., Bio/technology (1994) 12, 699-702).

Кроме того, при использовании тутового шелкопряда его инфицируют бакуловирусом, в который встроен ген желаемого антитела, и желаемое антитело получают из жидкости тела этого тутового шелкопряда (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Кроме того, при использовании табака ген желаемого антитела встраивают в экспрессирующий вектор для растений (например, рМОN530), и вектор вводят в бактерии, такие как Agrobacterium tumefacies. Эту бактерию используют для инфицирования табака (например, Nicotiana tabacum) с получением желаемого антитела из листьев этого табака (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

При продуцировании антитела в in vitro или in vivo системах продуцирования, как описано выше, ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) и легкую цепь (L-цепь) антитела, можно встроить в отдельные экспрессирующие векторы, и хозяина затем котрансформируют этими векторами. Альтернативно, ДНК можно встроить в один экспрессирующий вектор для трансформации хозяина (см. публикацию международной заявки на патент № WO 94/11523).

Используемые в настоящем изобретении антитела могут быть фрагментами антител или их модифицированными продуктами при условии, что их можно использовать подходящим образом в настоящем изобретении. Например, фрагменты антител включают Fab, F(ab')₂, Fv и одноцепочечный Fv (scFv), в котором Н- и L-цепи связаны через соответствующий линкер.

В частности, фрагменты антител получают обработкой антитела ферментом, например папаином или пепсином, и, альтернативно, гены, кодирующие эти фрагменты, конструируют, встраивают в экспрессирующие векторы и экспрессируют в соответствующей клетке-хозяине (см., например, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

scFv можно получить связыванием V-области Н-цепи и V-области L-цепи антитела. В scFv V-область Н-цепи и V-область L-цепи связаны через линкер, предпочтительно через пептидный линкер (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). V-области Н- и L-цепей в scFv могут происходить из любого антитела, описанного выше. Пептидные линкеры для связывания V-областей включают, например, произвольный одноцепочечный пептид, состоящий из 12-19 аминокислотных остатков.

Кодирующую scFv ДНК можно получить, используя ДНК, кодирующую Н-цепь или ее V-область, и ДНК, кодирующую L-цепь или ее V-область упоминаемых выше антител, в качестве матриц, амплифицируя с помощью ПЦР часть ДНК, которая кодирует желаемую аминокислотную последовательность в последовательности матрицы, с использованием праймеров, определяющих концы указанной части, и затем, кроме того, амплифицируя амплифицированную часть ДНК с использованием кодирующей часть пептидного линкера ДНК и пары праймеров, которые связывают оба конца линкера с Н-цепью и L-цепью.

Кроме того, после получения кодирующей scFv ДНК можно получить экспрессирующий вектор, включающий ДНК, и хозяина, трансформированного этим вектором, в соответствии с традиционными способами. Кроме того, scFv можно получить в соответствии с традиционными способами, используя хозяина.

Аналогично тому, что отмечено выше, фрагменты антител можно получить из хозяина путем получения и экспрессии его генов. Здесь «антитело» охватывает эти фрагменты антител.

В качестве модифицированного антитела можно также использовать антитело, связанное с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Здесь «антитело» охватывает эти модифицированные антитела. Эти модифицированные антитела можно получить с помощью химической модификации полученных антител. Такие способы уже широко известны в данной области техники.

Антитела, продуцированные и экспрессированные, как указано выше, можно выделить из внутреннего или наружного содержимого клетки или из хозяина и очистить до гомогенности. Выделение и/или очистку антител, используемых для настоящего изобретения, можно провести с помощью аффинной хроматографии. Колонки, используемые для аффинной хроматографии, включают, например, колонку с белком А и колонку с белком G. Носители, используемые для колонки с белком А, включают, например, HyperD, POROS, SepharoseF.F. и т.п. Помимо вышеуказанных, можно использовать другие способы выделения и/или очистки широко распространенных белков, и они не ограничены никоим образом.

Например, антитела, используемые для настоящего изобретения, можно выделить и/или очистить с помощью соответствующего отбора и сочетания хроматографий, помимо аффинной хроматографии, фильтров, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п. Хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию и т.п. Эти хроматографии можно применить к жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Альтернативно, можно использовать обращенно-фазовую HPLC.

Концентрацию антител, получаемых, как указано выше, можно определить с помощью измерения оптической плотности (OD), ELISA или т.п. В частности, оптическую плотность измеряют с помощью соответствующего разведения раствора антитела PBS(-), измерения оптической плотности при 280 нм и расчета концентрации (1,35 OD=1 мг/мл). Альтернативно, при использовании ELISA измерение можно проводить следующим образом. В частности, 100 мкл антитела козы против IgG человека (TAG), разведенного до 1 мкг/мл 0,1 М бикарбонатным буфером (рН 9,6), добавляют в 96-луночный планшет (Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4^οС для иммобилизации антитела. После блокирования добавляют 100 мкл соответствующим образом разведенного антитела настоящего изобретения или соответствующим образом разведенного образца, содержащего антитело, и IgG человека (CAPPEL) в качестве стандарта и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.

После промывки добавляют 100 мкл разведенного в 5000 раз антитела против IgG человека, меченного щелочной фосфатазой, (BIO SOURCE) и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. После еще одной промывки добавляют раствор субстрата и инкубируют, и оптическую плотность при 405 нм измеряют, используя считывающее устройство для микропланшетов модели 3550 (Bio-Rad) с расчетом концентрации представляющего интерес антитела.

Варианты IL-6, используемые в настоящем изобретении, представляют собой вещества, обладающие активностью связываться с рецептором IL-6 и не передающие биологическую активность IL-6. Т.е. варианты IL-6 конкурируют с IL-6 за связывание с рецепторами IL-6, но не передают биологическую активность IL-6, следовательно, блокируя опосредуемую IL-6 передачу сигнала.

Варианты IL-6 получают введением мутации(й) благодаря замене аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности IL-6. Источник IL-6, используемый в качестве основы для вариантов IL-6, не ограничен; однако предпочтительным является IL-6 человека, принимая во внимание его антигенность и т.п.

Более конкретно, замену аминокислоты осуществляют путем прогнозирования вторичной структуры аминокислотной последовательности IL-6, используя известные программы молекулярного моделирования (например, WHATIF; Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56), и дальнейшей оценки влияния замененного аминокислотного остатка(ов) на всю молекулу. После определения соответствующего аминокислотного остатка, подлежащего замене, осуществляют обычно проводимые методы ПЦР, используя кодирующую ген IL-6 человека нуклеотидную последовательность в качестве матрицы, с введением мутаций так, чтобы аминокислоты заменялись, и, таким образом, получают ген, кодирующий вариант IL-6. При необходимости этот ген встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор, и вариант IL-6 можно получить, применяя упоминаемые выше способы экспрессии, продукции и очистки рекомбинантных антител.

Конкретные примеры вариантов IL-6 раскрыты Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96/18648 и WO 96/17869.

Частичные пептиды IL-6 и частичные пептиды рецепторов IL-6, используемые в настоящем изобретении, представляют собой вещества, обладающие активностью связываться с рецепторами IL-6 и IL-6, соответственно, и не передающие биологическую активность IL-6. А именно, связываясь и захватывая рецептор IL-6 или IL-6, частичный пептид IL-6 или частичный пептид рецептора IL-6, в частности, ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6. В результате биологическая активность IL-6 не передается, и, следовательно, блокируется опосредуемая IL-6 передача сигнала.

Частичные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 являются пептидами, включающими часть или всю аминокислотную последовательность района аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6, вовлеченного в связывание IL-6 и рецептора IL-6. Такие пептиды обычно включают 10-80, предпочтительно 20-50, более предпочтительно 20-40 аминокислотных остатков.

Частичные пептиды IL-6 или частичные пептиды рецептора IL-6 можно получить в соответствии с обычно известными способами, например методами генной инженерии или методом синтеза пептида, путем точного определения района аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6, который вовлечен в связывание IL-6 или рецептора IL-6, и использования части или всей аминокислотной последовательности определенной области.

При получении частичного пептида IL-6 или частичного пептида рецепторов IL-6 с помощью метода генной инженерии ДНК-последовательность, кодирующую желаемый пептид, встраивают в экспрессирующий вектор, и затем можно получить пептид, применяя упоминаемые выше способы экспрессии, продукции и очистки рекомбинантных антител.

Для получения частичного пептида IL-6 или частичного пептида рецепторов IL-6 с помощью методов синтеза пептида можно использовать обычно используемые методы синтеза пептида, например методы твердофазного синтеза или методы жидкофазного синтеза.

В частности, синтез можно проводить в соответствии с методом, описанным в “Continuation of Development of Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis (in Japanese)(ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)”. В качестве метода твердофазного синтеза можно использовать, например, следующий метод: аминокислоту, соответствующую С-концу синтезируемого пептида, связывают с носителем, не растворимым в органических растворителях, затем осуществляют элонгацию пептидной цепи с помощью поочередного повторения (1) реакции конденсирования аминокислот, α-аминогруппы и функциональные группы разветвленных цепей которых защищены соответствующими защитными группами, по одной каждый раз в направлении от С к N-концу; и (2) реакции удаления защитных групп с α-аминогрупп связанных со смолой аминокислоты или пептида. Твердофазный пептидный синтез на основе типа используемой защитной группы, в общем, разделяют на два класса: Вос-метод и Fmoc-метод.

Вслед за синтезом представляющего интерес белка, как указано выше, проводят реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептидной цепи от носителя. Для реакции отщепления пептидной цепи, как правило, используют фтороводород или трифторметансульфокислоту для Вос-метода и TFA для Fmoc-метода. В соответствии с Вос-методом, например, упоминаемую выше смолу с защищенным пептидом обрабатывают фтороводородом в присутствии анизола. Затем пептид извлекают с помощью удаления защитной группы и отщепления пептида от носителя. С помощью высушивания при замораживании извлеченного пептида можно получить неочищенный пептид. С другой стороны, в Fmoc-методе, например, реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептидной цепи от носителя можно выполнить в TFA с помощью метода, сходного с описанным выше.

Полученный неочищенный пептид можно отделить и/или очистить, используя HPLC. Элюцию можно проводить в оптимальных условиях, используя систему растворителей вода-ацетонитрил, которую обычно используют для очистки белков. Фракции, соответствующие пикам получаемого хроматографического профиля, собирают и высушивают при замораживании. Таким образом, фракции очищенного пептида идентифицируют с помощью анализа молекулярной массы через анализ масс-спектра, анализ аминокислотного состава, анализ аминокислотной последовательности и т.п.

Конкретные примеры частичных пептидов IL-6 и частичных пептидов рецепторов IL-6 раскрыты в JP-A (Kokai) H02-188600, JP-A (Kokai) H07-324097, JP-A (Kokai) H08-311098 и публикации патента США № US 5210075.

Антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть также конъюгированными антителами, которые связаны с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG), радиоактивные вещества и токсины. Такие конъюгированные антитела можно получить с помощью химической модификации полученных антител. Способы модифицирования антител уже широко известны в данной области техники. «Антитела» настоящего изобретения охватывают эти конъюгированные антитела.

Агенты настоящего изобретения, подавляющие повреждение трансплантированных островков после трансплантации островков, можно использовать для лечения диабета. Диабет включает диабет типа 1, диабет типа 2, панкреатический диабет, гестационный диабет и т.п. Вышеуказанный диабет также включает вторичный диабет, вызванный панкреатитом или индуцированный использованием стероидных лекарственных средств, и диабет вследствие специфических причин, такой как диабет, вызванный нарушениями конкретных генов.

Агенты настоящего изобретения, подавляющие повреждение трансплантированных островков, можно использовать при трансплантации островков. Трансплантация островков включает трансплантацию островков от доноров после смерти их головного мозга, от доноров с остановкой сердца и от живых доноров.

Трансплантация островков в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой как изотрансплантаты, так и аллотрансплантаты. Изотрансплантаты представляют собой трансплантации между животными гомогенной системы, которые в случае людей являются трансплантацией между идентичными близнецами. Аллотрансплантаты представляют собой трансплантации между индивидуумами одного и того же вида, генетически различными, которые в случае людей являются трансплантацией между полностью неродственными индивидуумами или между двуяйцовыми близнецами. В настоящем изобретении активность ингибиторов IL-6 в отношении ингибирования передачи сигнала от IL-6 можно оценить с помощью традиционных способов. В частности, IL-6 добавляют в культуры зависимых от IL-6 линий клеток миеломы человека (S6B45 и KPMM2), линии КТ3 клеток Т-лимфомы Леннерта человека или зависимой от IL-6 клеточной линии MH60.BSF2; и поглощение ³Н-тимидина IL-6-зависимыми клетками измеряется в присутствии ингибитора IL-6. Альтернативно, культивируют экспрессирующие рецептор IL-6 клетки U266 и в одно и то же время в культуру добавляют меченный ¹²⁵I IL-6 и ингибитор IL-6; и затем определяют количество меченного ¹²⁵I IL-6, связанного с экспрессирующими рецептор IL-6 клетками. Помимо группы ингибитора IL-6, в систему анализа, описанную выше, включают группу отрицательного контроля, которая не содержит ингибитор IL-6. Активность ингибитора IL-6 ингибировать IL-6 оценивают сравнением результатов в обеих группах.

Как продемонстрировано ниже в примерах, введение антитела против рецептора IL-6, как обнаружено, подавляет повреждение трансплантированных островков после трансплантации островков. Это обнаружение говорит о том, что ингибиторы IL-6, такие как антитела против рецептора IL-6, применимы в качестве агентов, подавляющих повреждение трансплантированных островков после трансплантации островков.

Субъекты, которым вводят агенты настоящего изобретения, подавляющие повреждение трансплантированных островков, являются млекопитающими. Предпочтительно млекопитающими являются люди.

Агенты настоящего изобретения, подавляющие повреждение трансплантированных островков, можно вводить в качестве лекарственных средств и их можно вводить системно или местно посредством перорального или парентерального введения. Например, можно выбрать внутривенную инъекцию, такую как капельное внутривенное вливание, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, подкожную инъекцию, суппозиторий, клизму, пероральные энтеросолюбильные таблетки и т.п. Соответствующий способ введения можно выбрать в зависимости от возраста и симптомов пациента. Эффективную дозу на введение выбирают из диапазона, составляющего 0,01-100 мг/кг веса тела. Альтернативно, дозу можно выбрать из диапазона 1-1000 мг/пациент, предпочтительно из диапазона 5-50 мг/пациент. Предпочтительной дозой и способом введения являются следующие: например, при использовании антитела против рецептора IL-6 эффективная доза представляет собой такое количество, что в крови присутствует свободное антитело. В частности, вводят дозу 0,5-40 мг/кг веса тела/месяц (четыре недели), предпочтительно 1-20 мг/кг веса тела/месяц, посредством внутривенной инъекции, такой как капельное внутривенное вливание, подкожной инъекции или т.п., от одного до нескольких раз в месяц, например, дважды в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели или один раз каждые четыре недели. Схему введения можно регулировать путем, например, удлинения интервала введения от дважды в неделю или один раз в неделю до одного раза каждые две недели, одного раза каждые три недели или одного раза каждые четыре недели при контролировании состояния после трансплантации и изменений проверяемых величин в крови.

В настоящем изобретении агенты, подавляющие повреждение трансплантированных островков, могут содержать фармацевтически приемлемые носители, такие как консерванты и стабилизаторы. «Фармацевтически приемлемые носители» относятся к материалам, которые можно вводить вместе с описанным выше агентом; и они могут или не могут сами вызывать описанный выше эффект подавления повреждения трансплантированных островков. Альтернативно, носители могут являться материалами, которые не обладают способностью вызывать эффект подавления повреждения трансплантированных островков, но могут вызывать аддитивный или синергетический стабилизирующий эффект при использовании в комбинации с ингибитором IL-6.

Такие фармацевтически приемлемые материалы включают, например, стерильную воду, физиологический раствор, стабилизаторы, наполнители, буферы, консерванты, детергенты, хелатообразующие агенты (EDTA и т.п.) и связующие вещества.

В настоящем изобретении детергенты включают неионные детергенты, и типичные примеры таких детергентов включают эфиры сорбита и жирных кислот, такие как сорбитмонокаприлат, сорбитмонолаурат и сорбитмонопальмитат; эфиры глицерина и жирных кислот, такие как глицеринмонокаприлат, глицеринмономиристат и глицеринмоностеарат; эфиры полиглицерина и жирной кислоты, такие как декаглицерилмоностеарат, декаглицерилдистеарат и декаглицерилмонолинолеат; полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирной кислоты, такие как полиоксиэтиленсорбитмонолаурат, полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, полиоксиэтиленсорбитмоностеарат, полиоксиэтиленсорбитмонопальмитат, полиоксиэтиленсорбиттриолеат и полиоксиэтиленсорбиттристеарат; полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирной кислоты, такие как полиоксиэтиленсорбиттетрастеарат и полиоксиэтиленсорбиттетраолеат; полиоксиэтиленовые эфиры глицерина и жирной кислоты, такие как полиоксиэтиленглицерилмоностеарат; сложные эфиры полиэтиленгликоля и жирной кислоты, такие как полиэтиленгликольдистеарат; простые полиоксиэтиленовые эфиры, такие как полиоксиэтиленовый эфир лаурилового спирта; полиоксиэтиленполиоксипропиленовые эфиры алкилового спирта, такие как полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, полиоксиэтиленполиоксипропиленовый эфир пропилового спирта и полиоксиэтиленполиоксипропиленовый эфир цетилового спирта; алкилфениловые эфиры полиоксиэтилена, такие как нонилфениловый эфир полиоксиэтилена, полиоксиэтилен-затвердевшее касторовое масло, такой как полиоксиэтилен-касторовое масло и полиоксиэтилен-затвердевшее касторовое масло (полиоксиэтилен-гидрированное касторовое масло); производные полиоксиэтилена-пчелиного воска, такие как полиоксиэтиленсорбитвоск; производные полиоксиэтиленланолина, такие как полиоксиэтиленланолин; и полиоксиэтилен-амид жирной кислоты и т.п. с HLB 6-18, такой как полиоксиэтилен-амид стеариновой кислоты.

Детергенты также включают анионные детергенты, и типичные примеры таких детергентов включают, например, алкилсульфаты, имеющие алкильную группу с 10-18 атомами углерода, такие как натрия цетилсульфат, натрия лаурилсульфат и натрия олеилсульфат; полиоксиэтиленовые эфиры алкилового спирта и серной кислоты, в которых алкильная группа имеет 10-18 атомов углерода и среднее молярное число добавленного этиленоксида составляет 2-4, такие как натрия полиоксиэтиленлаурилсульфат, соли, образованные из сложных эфиров алкилового спирта и сульфоянтарной кислоты, имеющие алкильную группу с 8-18 атомами углерода, такие как натрия лаурилсульфосукцинат, встречающиеся в природе детергенты, например, лецитин; глицерофосфолипиды; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; сложные эфиры сахарозы и жирной кислоты, в которых жирные кислоты имеют 12-18 атомов углерода.

Один, два или более описанных выше детергентов можно объединить и добавить к агентам настоящего изобретения. Детергенты, которые предпочтительно использовать в препаратах настоящего изобретения, включают полиоксиэтиленовые сложные эфиры сорбитана и жирной кислоты, такие как полисорбаты 20, 40, 60 и 80. Особенно предпочтительными являются полисорбаты 20 и 80. Также являются предпочтительными полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоли, такие как полоксамер (Pluronic F-68® и т.п.).

Количество добавляемого детергента варьирует в зависимости от типа используемого детергента. При использовании полисорбата 20 или 80 количество, как правило, находится в диапазоне 0,001-100 мг/мл, предпочтительно в диапазоне 0,003-50 мг/мл, более предпочтительно в диапазоне 0,005-2 мг/мл.

В настоящем изобретении буферы включают фосфатный, цитратный буфер, уксусную кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту, янтарную кислоту, молочную кислоту, калия фосфат, глюконовую кислоту, капроновую кислоту, дезоксихолевую кислоту, салициловую кислоту, триэтаноламин, фумаровую кислоту и другие органические кислоты; и буфер угольной кислоты, Tris-буфер, гистидиновый буфер и имидазольный буфер.

Жидкие препараты можно приготовить растворением агентов в жидких буферах, известных в области жидких препаратов. Концентрация буфера, как правило, находится в диапазоне 1-500 мМ, предпочтительно в диапазоне 5-100 мМ, более предпочтительно в диапазоне 10-20 мМ.

Агенты настоящего изобретения могут также включать другие полипептиды с низкими молекулярными массами; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин; аминокислоты; сахара и углеводороды, такие как полисахариды и моносахариды, сахарные спирты и т.п.

Здесь аминокислоты включают основные аминокислоты, например аргинин, лизин, гистидин и орнитин, и неорганические соли этих аминокислот (предпочтительно соли гидрохлориды и соли фосфаты, а именно фосфаты аминокислот). При использовании свободных аминокислот рН доводят до предпочтительной величины добавлением соответствующих физиологически приемлемых буферных веществ, например неорганических кислот, в частности соляной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, уксусной кислоты и муравьиной кислоты и их солей. В этом случае использование фосфата является особенно полезным, поскольку он дает вполне стабильные к высушиванию при замораживании продукты. Фосфат является особенно выгодным, когда препараты по существу не содержат органических кислот, таких как яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота и фумаровая кислота, или не содержат соответствующих анионов (малат-иона, тартрат-иона, цитрат-иона, сукцинат-иона, фумарат-иона и т.п.). Предпочтительными аминокислотами являются аргинин, лизин, гистидин и орнитин. Кроме того, можно использовать кислые аминокислоты, например глютаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту, и их соли (предпочтительно соли натрия); нейтральные аминокислоты, например изолейцин, лейцин, глицин, серин, треонин, валин, метионин, цистеин и аланин; и ароматические аминокислоты, например фенилаланин, тирозин, триптофан и их производные, N-ацетилтриптофан.

Здесь сахара и углеводороды, такие как полисахариды и моносахариды, включают, например, декстран, глюкозу, фруктозу, лактозу, ксилозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу и раффинозу.

Здесь сахарные спирты включают, например, маннит, сорбит и инозит.

При приготовлении агентов настоящего изобретения в виде водных растворов для инъекции агенты можно смешать, например, с физиологическим раствором и/или изотоническим раствором, содержащим глюкозу или другие вспомогательные агенты (такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия). Водные растворы можно использовать в комбинации с соответствующими солюбилизирующими агентами, такими как спирты (этанол и т.п.), полиспирты (пропиленгликоль, PEG и т.п.) или неионные детергенты (полисорбат 80 или НСО-50).

Агенты могут, кроме того, включать, если требуется, разбавители, солюбилизаторы, рН-регуляторы, успокаивающие средства, содержащие серу восстановители, антиоксиданты и т.п.

Здесь содержащие серу восстановители включают, например, соединения, включающие сульфгидрильные группы, такие как N-ацетилцистеин, N-ацетилгомоцистеин, липоевая кислота, тиодигликоль, тиоэтаноламин, тиоглицерин, тиосорбит, тиогликолевая кислота и ее соли, натрия тиосульфат, глютатион и тиоалкановые кислоты, имеющие 1-7 атомов углерода.

Кроме того, антиоксиданты настоящего изобретения включают, например, эритроновую кислоту, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, ацетат токоферола, L-аскорбиновую кислоту и ее соли, пальмитат L-аскорбиновой кислоты, стеарат L-аскорбиновой кислоты, бисульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат, пропилгаллат, и хелатообразующие агенты, такие как динатриевая соль этилендиаминтетраацетата (EDTA), пирофосфат натрия и метафосфат натрия.

Если требуется, агенты можно заключить в микрокапсулы (микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы, желатина, поли[метилметакриловой кислоты] или т.п.) или приготовить в виде коллоидных систем доставки лекарственных средств (липосомы, альбуминовой микросферы, микроэмульсии, наночастиц, нанокапсул и т.п.) (см. “Remington's Pharmaceutical Science 16^th edition”, Oslo Ed., 1980, и т.п.). Кроме того, также известны способы приготовления агентов в виде агентов с пролонгированным действием, и они применимы в настоящем изобретении (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; патент США № 3773919; заявка на Европейский патент № (ЕР) 58481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; и ЕР 133988).

Используемые фармацевтически приемлемые носители соответствующим образом выбирают, без ограничения, из тех, которые описаны выше, или объединяют в зависимости от типа формы дозы.

Настоящее изобретение относится к способам подавления повреждения трансплантированных островков, которые включают стадию введения ингибитора IL-6 субъектам с трансплантацией островков. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам увеличения жизнеспособности трансплантированных островков у субъекта, которые включают стадию введения субъектам с трансплантацией островков ингибитора IL-6.

Здесь «субъект» относится к организмам, частям тела организмов или иссекаемой или доставляемой части организмов, в которые вводится агент настоящего изобретения для подавления повреждения трансплантированных островков. Организмы включают, но без особого ограничения, животных (например, человека, виды домашних животных и диких животных).

«Части тела организмов» особенно не ограничены, но предпочтительно включают трансплантируемые органы с островками, более большим сальником, субренальной капсулой и брыжейкой. В настоящем изобретении трансплантируемые органы с островками включают печень и, в частности, кровеносные сосуды печени.

Здесь «введение» включает пероральное и парентеральное введения. Пероральное введение включает, например, введение оральных агентов. Такие оральные агенты включают, например, гранулу, порошок, таблетку, капсулу, раствор, эмульсию и суспензию.

Парентеральное введение включает, например, инъекции. Такие инъекции включают, например, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию и внутрибрюшинную инъекцию. Между тем, эффекты способов настоящего изобретения можно достигнуть введением включающих олигонуклеотиды генов, подлежащих введению в живые организмы, используя методы генной терапии. Альтернативно, агенты настоящего изобретения можно вводить местно в предназначенные для лечения области. Например, агенты можно вводить с помощью местной инъекции во время операции, используя катетеры, или нацелить на генную доставку ДНК, кодирующей пептид настоящего изобретения.

Подавляющие агенты настоящего изобретения можно вводить субъектам до трансплантации органа, во время трансплантации органа или после трансплантации органа. Кроме того, подавляющие агенты можно вводить один раз или повторно.

Альтернативно, при введении в иссекаемую или доставляемую часть организма подавляющие агенты настоящего изобретения можно «привести в контакт» с частью организма.

В настоящем изобретении «приведение в контакт» осуществляют в соответствии с состоянием организма. Примеры включают, но без ограничения, распыление подавляющих агентов настоящего изобретения на части организма или добавление подавляющих агентов настоящего изобретения в раздавленные части организма. Когда частью организма являются культивируемые клетки, упоминаемый выше «контакт» можно осуществить добавлением подавляющих агентов настоящего изобретения в культуральную среду этих клеток или введением ДНК, включающей олигонуклеотиды настоящего изобретения, в клетки, образующие часть организма.

При проведении способов настоящего изобретения подавляющие агенты настоящего изобретения можно вводить в виде частей фармацевтических композиций в комбинации с по крайней мере одним известным химиотерапевтическим агентом. Альтернативно, подавляющие агенты настоящего изобретения можно вводить одновременно с по крайней мере одним известным иммунодепрессантом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения известные химиотерапевтические агенты и подавляющие агенты настоящего изобретения можно вводить фактически одновременно.

Подавляющие агенты настоящего изобретения можно вводить в места трансплантации островков после того, как островки были трансплантированы, или их можно вводить в мишени в то же самое время, что и в островки. Альтернативно, агенты можно добавлять к островкам in vitro, до трансплантации.

Здесь выражение «подавление повреждения трансплантированных островков» означает, что повреждение трансплантированных островков подавляется, а жизнеспособность увеличивается. Выражение «подавление повреждения трансплантированных островков» также включает подавление встречающихся в природе иммунных ответов, сопровождающих трансплантацию.

Подавление повреждения трансплантированных островков можно подтвердить с помощью измерения уровней сахара в крови в живых организмах в соответствии со способами, описанными в примерах. Уровни сахара в крови можно измерить, например, путем сбора крови из глазной впадины и определения уровней сахара в крови с использованием анализатора глюкозы Beckman после сбора плазмы.

Когда введение агентов настоящего изобретения для подавления повреждения трансплантированных островков приводит к устойчивому снижению уровня сахара в крови, повреждение трансплантированных островков считают подавленным. Альтернативно, когда в результате такого введения выживаемость островков увеличивается, также является верным заключение, что агенты «подавляют повреждение трансплантированных островков» после трансплантации островков. Выживаемость островков можно оценить с помощью определения того, восстанавливаются ли или нет нормальные уровни сахара в крови после трансплантации страдающим диабетом реципиентам. Например, когда 200 островков, которые можно выделить от одного донора, трансплантируют контрольной группе, описанной здесь в примерах, а гипергликемическое состояние сохраняется, жизнеспособность можно, следовательно, принять за 0%. Однако когда то же самое число островков, используемое для контрольной группы, трансплантируют группе, которой вводят антитело против рецептора IL-6, описанной здесь в примерах, и у всех реципиентов восстанавливаются нормальные уровни сахара в крови, жизнеспособность, следовательно, принимают за 100%.

Все процитированные здесь документы предшествующего уровня техники включены сюда посредством ссылки.

[Примеры]

Здесь ниже настоящее изобретение будет специально описано со ссылкой на примеры, но не следует заключать, что оно ограничено ими.

[Пример 1] Исследование подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации изогенных островков, при котором эффект обусловлен введением антител против рецептора IL-6

Мышей-реципиентов, страдающих диабетом, готовили с помощью внутривенного введения стрептозотоцина (180 мг/кг) самцам мышей С57BL/6. Стрептозотоцин является агентом, который избирательно разрушает панкреатические островки Лангерганса. Единственное введение стрептозотоцина приводит к элиминации большинства В-клеток и, следовательно, индуцирует диабет типа 1.

Без островкового трансплантата все мыши сохраняли гипергликемические состояния (фиг. 1). Через три-пять дней после введения стрептозотоцина выделенные изогенные островки мышей трансплантировали в печени страдающих диабетом мышей через воротную вену. Островки выделяли из поджелудочной железы донора, используя основанные на коллагеназе способы.

Из поджелудочной железы одной мыши можно выделить 200 островков. В случае 400 донорских островков от двух мышей нормальные уровни сахара в крови восстанавливались после трансплантации страдающим диабетом реципиентам, и диабет мог быть вылечен (фиг. 2).

В этом примере кровь отбирали из глазной впадины, и уровни сахара в крови определяли с использованием анализатора глюкозы Beckman после сбора плазмы.

Однако трансплантация 200 островков одной мыши не восстанавливала нормальные уровни сахара в крови, и реципиенты сохраняли гипергликемические состояния (фиг. 3).

Когда 500 мкг антитела против рецептора IL-6 (MR16-1) внутрибрюшинно вводили трижды после трансплантации 200 островков (в дни 0, 2 и 4), нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у всех реципиентов после трансплантации (фиг. 4). Когда один раз вводили равную дозу антитела против рецептора IL-6, нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у ¾ реципиентов (фиг. 5). Альтернативно, когда один раз вводили 200 мкг антитела против рецептора IL-6, нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у ¹/₃ реципиентов (фиг. 6).

Вышеуказанные результаты показывают, что антитела против рецептора IL-6 уменьшают повреждение трансплантированных островков, увеличивают выживаемость островков и корректируют гипергликемию у реципиентов. В частности, обнаружено, что антитела против рецептора IL-6 можно использовать в качестве агентов, подавляющих повреждение трансплантированных островков после трансплантации изогенных островков (изотрансплантатов).

[Пример 2] Исследование подавления продукции воспалительных цитокинов, при котором эффект обусловлен введением антител против рецептора IL-6

Для исследования того, подавляет ли введение антител против рецептора IL-6 настоящего изобретения продукцию после трансплантации воспалительных цитокинов инфильтрующими клетками, использовали способы проточного цитометрического анализа.

200 изогенных островков трансплантировали в печени мышей с вызванным стрептозотоцином диабетом, и через шесть часов животных умерщвляли, из печени выделяли мононуклеарные клетки печени и их анализировали с помощью проточной цитометрии (фиг. 7).

В мононуклеарных клетках печени необработанных мышей продукции IFN-γ и TNF-α не наблюдалось. Продукция IFN-γ и TNF-α была увеличена в мононуклеарных клетках печени контрольной группы, которой не вводили антитела против рецептора IL-6. Продукции IFN-γ и TNF-α не наблюдалось в мононуклеарных клетках печени мышей, которым вводили антитела против рецептора IL-6 один раз (внутрибрюшинно; 200 мкг/инъекция/мышь) во время трансплантации. Эти обнаружения говорят о том, что введение антител против рецептора IL-6 предотвращает повреждение трансплантированных островков путем подавления продукции воспалительных цитокинов.

[Пример 3] Исследование подавления повреждения трансплантированных островков при трансплантации аллогенных островков, при котором эффект обусловлен введением антител против рецептора IL-6

Мышей-реципиентов, страдающих диабетом, готовили с помощью внутривенного введения стрептозотоцина (180 мг/кг) самцам мышей С57BL/6. Через три-пять дней после введения стрептозотоцина выделенные аллогенные островки мышей трансплантировали в печени страдающих диабетом мышей (BALB/c) через воротную вену. Островки выделяли из островков донора, используя основанные на коллагеназе способы. Уровни сахара в крови определяли с помощью того же способа, который описан в примере 1.

После трансплантации 200 островков 500 мкг антитела против рецептора IL-6 (MR16-1) внутрибрюшинно вводили трижды (в дни 0, 2 и 4) и 200 мкг антитела против CD4 внутрибрюшинно вводили один раз в то же самое время, что и первое введение антитела против рецептора IL-6, и нормальные уровни сахара в крови восстанавливались у всех реципиентов после трансплантации (фиг. 10). С другой стороны, когда вводили 500 мкг контрольного антитела (IgG крысы) (фиг. 8) или 200 мкг антитела против CD4 только (фиг. 9) такое же число раз, все мыши сохраняли гипергликемические состояния.

Вышеуказанные результаты показывают, что у реципиентов, получающих аллотрансплантаты, антитела против рецептора IL-6 также уменьшают повреждение трансплантированных островков, увеличивают выживаемость островков и корректируют гипергликемию. В частности, обнаружено, что антитела против рецептора IL-6 можно использовать в качестве агентов, подавляющих повреждение трансплантированных островков после трансплантаций аллогенных островков.

Промышленная применимость

Способы и агенты настоящего изобретения для подавления повреждения трансплантированных островков увеличивают выживаемость островков после трансплантации островков и, как ожидают, делают возможным эффективное лечение диабета с использованием меньшего числа островков донора.

Ранее при трансплантации островков, выделенных из поджелудочных желез доноров после смерти их головного мозга или доноров с остановкой сердца, одному реципиенту требовались островки, выделенные из поджелудочных желез двух-трех доноров, поскольку возникало нарушение функции островков, которое уменьшало жизнеспособность трансплантатов. В результате использования агентов настоящего изобретения, подавляющих повреждение трансплантированных островков, число островков, требуемых для одного реципиента, уменьшается, и в результате, как ожидается, большему числу реципиентов можно провести трансплантации островков.

В недавних сообщениях описываются успешные случаи трансплантации островков от живых доноров, при которой островки выделяют и очищают из части поджелудочной железы, иссеченной у здорового донора, и трансплантируют больным диабетом; однако использование агентов настоящего изобретения для подавления повреждения трансплантированных островков, как полагают, сделает возможным разработку терапевтических способов, являющихся менее инвазивными для доноров.

Изобретение относится к медицине и касается эффекта подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островков антителами против рецептора IL-6. Изобретение обеспечивает уменьшение повреждения трансплантированных островков, увеличение выживаемости островков и корректировку гипергликемии у реципиентов. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 пр., 10 ил.

1. Агент для подавления повреждения трансплантированного островка после трансплантации островка, который включает антитело, которое распознает рецептор IL-6, в качестве активного ингредиента.

2. Агент для подавления повреждения трансплантированного островка по п.1, в котором антителом является моноклональное антитело.

3. Агент для подавления повреждения трансплантированного островка по п.1, в котором антителом является антитело против рецептора IL-6 человека.

4. Агент для подавления повреждения трансплантированного островка по п.1, в котором антителом является рекомбинантное антитело.

5. Агент для подавления повреждения трансплантированного островка по п.4, в котором антителом является химерное, гуманизированное антитело или антитело человека.

6. Агент для подавления повреждения трансплантированного островка по п.1, используемый для лечения диабета.

7. Способ подавления повреждения трансплантированных островков у субъекта с трансплантацией островков, который включает стадию введения субъекту антитела, которое распознает рецептор IL-6.

8. Способ увеличения жизнеспособности островка у субъекта с трансплантацией островка, который включает стадию введения субъекту антитела, которое распознает рецептор IL-6.

9. Способ по п.7 или 8, в котором антителом является моноклональное антитело.

10. Способ по п.7 или 8, в котором антителом является антитело против рецептора IL-6 человека.

11. Способ по п.7 или 8, в котором антителом является рекомбинантное антитело.

12. Способ по п.11, в котором антителом является химерное, гуманизированное антитело или антитело человека.

13. Применение антитела, которое распознает рецептор IL-6, для получения агентов, используемых для подавления повреждения трансплантированного островка после трансплантации островка.

14. Применение по п.13, при котором антителом является моноклональное антитело.

15. Применение по п.13, при котором антителом является антитело против рецептора IL-6 человека.

16. Применение по п.13, при котором антителом является рекомбинантное антитело.

17. Применение по п.16, при котором антителом является химерное, гуманизированное антитело или антитело человека.