СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ S-СУЛЬФОНАТА ПРОИНСУЛИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K7/40 C12P21/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению генно-инженерных инсулинсодержащих белков с использованием хроматографических методов очистки.

Известны методы выделения инсулинсодержащих белков и их аналогов с помощью методов хроматографии [1-2]. Технология представляет собой многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина человека, его переработку и постадийную очистку.

Недостатками известных методов являются сложная технология получения и очистки, многостадийность. низкие выходы промежуточных продуктов и соответственно конечного продукта.

Прототипом [3] изобретения является регламент на способ получения S-сульфоната проинсулина, включающий в себя расщепление бромцианом рекомбинантного белка, сульфотолиз, то есть обработку полученного белка тетратионатом натрия с образованием S-сульфоната проинсулина (ПСС) и выделение последнего в три стадии - 1) гельфильтрацией на сефадексе G-50 в бикарбонатном буферном растворе, 2) ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF в трис-буфере с линейным градиентом хлористого натрия и 3) обессоливанием на сефадексе G-25.

Недостатками прототипа являются многостадийность, низкий выход ПСС (около 30% ), плохая гидродинамика, связанная с применением мягкого геля, что затрудняет реализацию процесса в промышленных условиях.

Целью изобретения является разработка способа получения ПСС по более простой технологии и с более высоким выходом.

Это достигается тем, что выделение ПСС из смеси, полученной после обработки белка тетратионатом натрия, проводят на сополимере (30-50 мол.%) диметакрилата этиленгликоля (ДМАЭГ) с (70-50 мол.%) 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакри- латом (ДЭАПМ), получившим название ДЕАП-сферанит-ОН в 0,005-0,015 М уксусной кислоте, а элюцию проводят раствором, содержащим уксусную кислоту с ионной силой μ= 1±0,01. Оптимальный результат был получен при использовании в качестве элюента 1 М раствора уксусной кислоты, содержащего 4 М мочевину и 1 М хлористый натрий ( μ= =1,01).

Существенным отличием заявляемого способа является использование для этих целей ДЕАП-сферанита-ОН, сорбента, ранее применявшегося для выделения рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина, а также новых условий хроматографии, в частности применение для элюции растворов с высокой ионной силой, что позволило получить при использовании данного сорбента целевой продукт с высокой селективностью.

Использование указанных существенных отличий позволяет устранить стадию предварительной очистки на сефадексе G-50 и на 1/3 повысить выход целевого продукта.

На чертеже изображена хроматограмма выделения проинсулин-S-сульфоната на колонке с сорбентом ДЕАП-сферанит-ОН.

П р и м е р 1 (прототип). На колонку (5 х 60 см) объемом 1,2 л с сефадексом G-80, урановешенную 50 мМ буферным раствором бикарбоната аммония, наносят 20 мл раствора, содержащего 760 мг белка (ПСС), и элюируют тем же буферным раствором со скоростью 15 мл/ч. Фракции, содержащие ПСС, собирают, объединяют и получают 120 мл элюата, содержащего 677 мг белка. Его наносят на колонку (2,6 х 40 см), содержащую 160 мл сефарозы - ДЕАЕ, FF, уравновешенную буферным раствором, содержащим 30 мМ трис-гидрохлорида (рН 7,5), со скоростью 5 мл/мин. Колонку промывают тем же буфером 240 мл и элюируют ПСС, вводя в буфер линейный градиент хлористого натрия (0-0,25 М). Получают 10 мл элюата, содержащего 260 мг ПСС. Обессоливание проводят, нанося 10 мл элюата на колонку с сефадексом G-25, уравновешенным буферным раствором, содержащим 50 мМ глицина (рН 10,5), и элюируя тем же раствором. Фракции, содержащие ПСС, собирают и получают 20 мл элюата, содержащего 240 мг ПСС. Выход 31,6%.

П р и м е р 2. Колонку (2,1 х 6 см), содержащую 20 мл ДЕАП-сферанита-ОН, уравновешивают 0,01 М и раствором уксусной кислоты, 2,5 мл раствора, содержащего 0,125 г белка, полученного после расщепления бромцианом с последующим сульфотолизом, разбавляют 10 мл 0,01 М уксусной кислоты и наносят на колонку, промывают 3-4-кратным объемом 0,01 М уксусной кислоты, затем 2-3-кратным объемом 1М уксусной кислоты для удаления примесных белков. Элюцию ПСС проводят 1М раствором уксусной кислоты, содержащим 4 М мочевину и 1М хлористый натрий. После обессоливания элюата на колонке с сефадексом G-25 в буферном растворе 50 мМ бикарбоната аммония и лиофильного высушивания получают 0,058 г (40%) ПСС.

П р и м е р 3. Выделение ПСС проводят в условиях примера 2, используя сорбенты (ДЕАП-сфераниты-ОН), полученные при различных соотношениях мономеров. Данные приведены в табл.1.

П р и м е р 4. Выделение ПСС проводят в условиях примера 2, используя в качестве элюента растворы уксусной кислоты с различной ионной силой, с последующим обессоливанием на сефадексе G-25. Данные приведены в табл.2.

Показатели ионизации для уксусной кислоты и мочевины незначительны по сравнению с NaCl и равны соответственно 4,75 и 0,1. Ионная сила раствора определяется концентрацией ионов NaCl и равна для оптимальных условий элюции μ = 1±0,01.

Как следует из приведенных выше примеров, использование предлагаемого способа позволяет повыcить выход ПСС до 40% с одновременным исключением стадии предварительной очистки на сефадексе G-50.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению генно-инженерных инсулинсодержащих белков с использованием хроматографических методов очистки. Сущность изобретения: разработка способа получения продукта- S-сульфоната проинсулина с более высоким выходом по более простой технологии, что достигается проведением хроматографии на сополимере диметакрилата этиленгликоля с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом, а элюцию - раствором, содержащим уксусную кислоту. 1 з.п. ф-лы, 1 ил, 2 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ S-СУЛЬФОНАТА ПРОИНСУЛИНА, включающий расщепление бромцианом рекомбинантного белка, сульфитолиз, хроматографическое выделение целевого продукта с элюцией S-сульфоната проинсулина солевым раствором с последующим обессоливанием на сефадексе G-25, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения технологии, хроматографию проводят на сополимере диметакрилата этиленгликоля (30-50 мол.%) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (70-50 мол.%), а элюцию - раствором, содержащим уксусную кислоту, с ионной силой μ = 1 ± 0,01 . 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию проводят 1 М раствором уксусной кислоты, содержащим 4 М мочевину и 1 М хлористый натрий.