СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРОИНСУЛИНА Советский патент 1996 года по МПК C07K14/62 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения генноинженерного инсулина с использованием хроматографических методов очистки на анионитах.

Известны методы выделения инсулинсодержащих белков и их аналогов с помощью хроматографии. Технология представляет многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина (рБПИ), его очистку и переработку.

Недостатками известных методов являются сложная технология получения и очистки, низкие выходы целевых компонентов.

Прототипом заявляемого способа является способ получения генно-инженерного инсулина, включающий в себя культивирование микроорганизмов продуцентов инсулинсодержащих белков, выделение рекомбинатного белка, содержащего последовательность инсулина (рБПИ), его очистку на ДЕАЕ-Сефарозе в буферном растворе, содержащем трис-HCl с рН 7,5, элюцией рБПИ раствором 0,25 М NaСl в трис-HCl и последующим превращением рБПИ в инсулин.

Недостатком прототипа является низкий выход рБПИ (около 40%) и, как следствие, низкий выход инсулина. Недостатком сорбента является недостаточно высокая эффективность при очистке рБПИ.

Целью изобретения является разработка способа получения рБПИ с большим выходом.

Более высокий выход рБПИ достигается при проведении очистки на сополимере N, N'-диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (ГДЭПМ) с сорбцией белка 0,007-0,013 М уксусной кислотой, содержащей 0,15-0,30 М ацетата натрия, и элюцией рБПИ 0,8-1,1 М уксусной кислотой. При этом сорбент, получивший наименование ДЕАП-Сферанит-ОН, получают радикальной сополимеризацией ДМЭГ с ГДЭПМ в присутствии наряду с водным раствором хлористого натрия 11-13% от массы мономеров поливинилового спирта (ПВС) и 2-4% динитрилазоизомасляной кислоты (ДИНИЗ). Наряду с рБПИ сорбент может применяться и для очистки других белков.

Существенным отличием заявляемого способа получения является использование сорбента в новых условиях сорбции и элюции. Наиболее близким по структуре и свойствам к заявляемому сорбенту является анионит "СолозаАГ", получаемый радикальной суспензионной сополимеризацией N,N'-диэтиламиноэтилметакрилата с N,N'-метилен-бис-акриламилом в присутствии персульфата аммония и 0,3-3,0 н. водного раствора хлористого натрия.

Процесс идет в узком диапазоне всех перечисленных условий, изменение которых приводит к ухудшению условий разделения.

П р и м е р 1. На колонку (9 х 45 см), содержащую 3 л ДЕАЕ-Сефарозы, уравновешенную 30 мМ трис-НСl буферным раствором и рН 7,5 вводят 30 г рБПИ в 50 л этого же раствора со скоростью 100 мл/мин. По окончании сорбции колонку промывают тем же буфером 3-4-кратным объемом. Элюцию белка с колонки проводят 0,25 М NaCl в 30 мМ трис-HCl буфере с рН 7,5. После элюции рБПИ колонку регенерируют, промывая раствором 1 М NaCl в 30 мМ трис-HCl. Для обессоливания фракции, содержащие белок, наносили на колонку, содержащую 40 л Сефадекса G-25, уравновешенную 50 мМ раствором бикарбоната аммония. Элюцию проводили тем же буфером. Выход белка 37%
П р и м е р 2. На колонку (9 х 45 см), содержащую 3 л ДЕАЕ-Сферанита ОН с 0,2 М СН₃СООNa и 0,01 М уксусной кислотой, вводят 30 г рБПИ в 50 л 0,01 М уксусной кислоты, рН 7,5. Колонку промывают 3-4-кратным объемом 0,01 М уксусной кислоты. Элюцию белка с колонки проводят 1 М уксусной кислотой, рН 2,0. После элюции колонку регенерируют 50% -ной уксусной кислотой. Выход рБПИ 60-73%
П р и м е р 3. В условиях примера 2 были проведены опыты по очистке проинсулина на различных сорбентах анионитов сферанит-ОН, полученных при разных соотношениях мономеров. Полученные результаты представлены в табл.1 и 2.

П р и м е р 4. Получение рБПИ на прототипе-сорбенте Солоза АГ, негативный.

На колонку (9 х 45 см), содержащую 3 л Солозы АГ, уравновешенную 30 мМ трис-HCl буфером с рН 7,5, вводят 30 г рБПИ в 50 л этого же раствора со скоростью 100 мл/мин. По окончании сорбции колонку промывают 3-4-кратным объемом того же буфера. После этого колонку промывают тем же буфером, содержащим 1 М NaCl. Белок элюировали тем же буфером, содержащим 7 М мочевины и 1 М NaCl. Для обессоливания фракции, содержащие белок, наносили на колонку, содержащую 40 л Сефадекса G-25, уравновешенную 50 мМ раствором бикарбоната аммония. Элюцию проводили тем же буфером. Выход белка 40-50% Чистота не превышает 50%

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: хроматографическая очистка на анионите. С целью повышения выхода целевого продукта хроматографию проводят на сополимере диметакрилата этиленгликоля с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом в 0,007 - 0,013 М уксусной кислоте, содержащей 0,15 - 0,30 М ацетата натрия, а белок элюируют 0,8 - 1,1 М уксусной кислотой. Выход белка до 73%. 2 табл.

СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРОИНСУЛИНА, путем пропускания белоксодержащего раствора через колонку с анионитом и элюции сорбированного белка, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода белка, в качестве анионита используют сополимер диметакрилата этиленгликоля с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом, взятых в соотношении соответственно от 3 7 до 1 1, через колонку пропускают раствор белка в 0,007 0,013 М уксусной кислоте, содержащей 0,15 0,50 М ацетата натрия, а элюируют белок 0,8 1,1 М уксусной кислотой.