Способ получения ДНК-полимеразы 1 ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/19 

Изобретение относится к способам получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, а именно к способам получения ДНК-полимеразы I. К.coli, которая находит применение в генно- инженерных экспериментах.

Цель изобретения - повышение выхода и удельной активности фермента.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцента 7 НК-полиме- разы I используют личогенный штамм Eschcrichia coli NM 964 ГйКПМ В-2199), инфицированный термоиндуцнру&мым лиэогенным фагом , имеющим ген ро Л. Клетки Escherichia coli Nil 964 разрушают в 0,01 М калийфосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,001 М /3 -мер- каптоэтанола, 0,0001 КЭДТА и 65 мг/л лизоцима, обломки клеток осаждают

дин 49-50%, очистка - 62,7 раз (в из- ДО растворенного в 20 мл воды. После

перемешивания в течение 30 мин при банляют 24 г NaCI и перемешивают при 60°С епе 1 ч. Смесь нагревают 80 °С, прибавляют 2,1 г пер мешивают 2ч, фильтруют и отмывают Холодной и горячей (80 С) водой до получения бесцветного фильтрата. П лучается сорбент, содержащий 1,4 м красителя красно-коричневого 2К на мл CL сефарозы 6В. Приготовленный сорбент CL сефароза 6В - красно-ко невый 2К имеет формулу

вестном способе соответственно 46% и 50 раз). При хроматографии на солозе АГ выход фермента составляет 40-45%, очистка 880 раз (по известному способу соответственно 30% и 76 раз). По 45 анным электрофореза на ПААГ в присутствии DS-NA чистота ДНК-полимеразы I составляет 83,2%. Препарат прак- тически свободен от дезоксирибоэндону- клеаэных примесей. 50

Пример 1. Получение сорбента - солозы КГ 0/24.

No03S- N11

N

растворенного в 20 мл воды. После

перемешивания в течение 30 мин при- банляют 24 г NaCI и перемешивают при 60°С епе 1 ч. Смесь нагревают до 80 °С, прибавляют 2,1 г перемешивают 2ч, фильтруют и отмывают Холодной и горячей (80 С) водой до получения бесцветного фильтрата. Получается сорбент, содержащий 1,4 мкМ красителя красно-коричневого 2К на мл CL сефарозы 6В. Приготовленный сорбент CL сефароза 6В - красно-кориневый 2К имеет формулу

он соон

NH

SOjjNa

Изобретение относится к способам получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, а именно к способам получения ДНК-полимераэы I I .scheri- chia coli, инфицированной лизогенным фагом X. , которая находит применение в генноинженернмх эксперимента;;. Уелъ изобретения - повышение выхода и удельной активности фермента. Изобретение заключается в том, что после разрушения клеток, осаждения фермента из клеточного экстракта полими- ном II, фракционирования сульфатом аммония и обессолнвания осуществляют хроматографнческую очистку в три стадии: на солозе КГ 0/24, с элюцией в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 1,0 М в буферном растворе, на CL сефарозе 6В, связанной с лнган- дом-краснтелем красно-коричневым 2К при соотношении 1,2-2,4 мкМ красителя на 1 мл сефарозы, при элюцин в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 0,8 М в буферном растворе, и на солоэе АГ при элюцни фермента в аналогичных условиях. При этом на ПСРХ стадиях очистки в качестве исходного используют 0,005-0,05N калннфосфатный буфер, содержащий О,0005-0,005М /5-меркаптоэтанола и 0,05-0,5 мМ ЭДГА, рН 7,0-8,0. Изобретение позволяет получить г.ыход ДНК- полимеразы 1 45Я с удельной активностью 16000 гд./мг белка. 1 табл. с Ј V С а N: СС сс

О- сефароза CL-6B

в течение 1 ч. Выпавший осадок отбра сывают, центрифугят (1560 мл) исполь зуют для выделения фермента.

б) Фракционирование ферментного экстракта полимином II и сульфатом аммония. К центрифугату (1560 мл), полученному на предыдущей стадии, при постоянном перемешивании в течеДля определения концентрат красно-коричневого 2К на сефарозе п элю- енте измеряют оптическую плотность при 525 нм и согласно молярному коэффициенту экстинкции красителя (13500 л.) находят количество непрореагировавтего красно-коричневого 2К. Из разницы между взятым количеством красно-коричневого 2К )ф ние 30 мин добавляют 20%-ный раствор и найденным в элюенте находят количе- . полимина II (48 мл) до конечной кон- ство лиганда в мкмолях на мл сефарозы

Получение сорбента - солозы АГ.

Приготовление дисперсной среды. В термоетативный реактор емкостью t,5 л, снанбженный механической мешалкой с регулируемым числом оборотов, холодильником п трубкой для

центрации 0,6%. После добавления всего объема полимнна II перемешивание продолжают еще 30 мин. Экстракт цент- 15 рифугируют в течение 10 мин при

5000 g. Супернатант сливают, а полученный осадок суспендируют в 780 мл 0,01 М калийфосфатного буфера с рН 7, содержащего 0,001 М Я-меркаптоэтабарбатирования аргона, помещают

5000 g. Супернатант сливают, а по ченный осадок суспендируют в 780 0,01 М калийфосфатного буфера с р содержащего 0,001 М Я-меркаптоэт

тридекан (600 ч), содержащий Spnn-85, 20 пола, 0,0001 М ЭДТА и 0,05 М КС1.

проводят барбатаж аргоном в течение 0,5 ч.

Приготовление дисперсной фазы. В отдельной емкости на 0,5 л приготавливают раствор диэтиламиноэтилметак- риламида (26 ч.) в 1,7 М растворе натрия хлористого (360 ч.) и титруют до рН 7,6 соляной кислотой. В раствор вводят метиленбисакриламид (14 ч.) и инициатор - персульфат аммония (0,8 ч.), которые растворяют при нагревании в течение 2 мин.

Полимеризация. В дисперсую среду при перемевгивании 300 об./мин в течение 15 мин при комнатной температуре вводят дисперсную фазу. Включают обогрев реактора при 70 С. Процесс полимеризации проводят в течение 3 ч. Мешалку выключают, гранулы

Суспензию центрифугируют в течени 10 мин при 5000 р,. Супернатант сл вают, а ДНК-полимеразу I экстраги из осадка 1200 мл 0,01 М калнйфос

25 ного буфера с рН 7,4, содержащего 0,001 М й-меркаптоптанола, 0,1 м ЭДТА и 0,5 М КС1. Суспензию центр гируют в течение 10 мин при 5000 К супернатанту (1210 мл) добавляю

30 сухой сульфат аммония до 70% насы ния. Осадок собирают, растворяют 150 мл 0,01 М калнйфосфатного буф с рН 7,4, содержащего 0,001 М А-м каптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА, помещ

jj в диализную трубку и диалнзуют в чение 18 ч против 5 л указанного фера. Получают 180 мл диализата.

в) Хроматография ЛНК-полимераз на колонке с солозой КГ 0/24. Диали

сорбента отделяют от реактора фильт- 40 фермента (180 мл) подвергают хроматорованием, отмывают от трндеклна водо с детергентом и многократно водой. Фракционируют мокрым рассевом на ситах, выделяя фракции 50-100 мкм и 100-200 мкм.

Выл еле ни е и очистка ДНК-полимера- зы I.

а) Для получения ферментного экстракта 250 г клеток E.Coli NM 964 суспендируют в 1400 мл 0,01 М калий фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,001 М А-меркаптоэтанола, 0,0001 М ЭДТА и 65 мг/л лизоцима. Суспензию ставят в ледяную баню и перемешивают стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии. Суспензии клеток обрабатывают экструзионньм дезинтегратором. Обломки клеток осаждают центрифугированием при 10000 j

в течение 1 ч. Выпавший осадок отбрасывают, центрифугят (1560 мл) используют для выделения фермента.

б) Фракционирование ферментного экстракта полимином II и сульфатом аммония. К центрифугату (1560 мл), полученному на предыдущей стадии, при постоянном перемешивании в течение 30 мин добавляют 20%-ный раствор полимина II (48 мл) до конечной кон-

ние 30 мин добавляют 20%-ный раствор полимина II (48 мл) до конечной кон-

центрации 0,6%. После добавления всего объема полимнна II перемешивание продолжают еще 30 мин. Экстракт цент- рифугируют в течение 10 мин при

5000 g. Супернатант сливают, а полученный осадок суспендируют в 780 мл 0,01 М калийфосфатного буфера с рН 7,4 содержащего 0,001 М Я-меркаптоэтапола, 0,0001 М ЭДТА и 0,05 М КС1.

пола, 0,0001 М ЭДТА и 0,05 М КС1.

Суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 5000 р,. Супернатант слива- вают, а ДНК-полимеразу I экстрагируют из осадка 1200 мл 0,01 М калнйфосфатного буфера с рН 7,4, содержащего 0,001 М й-меркаптоптанола, 0,1 мМ ЭДТА и 0,5 М КС1. Суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 5000 g. К супернатанту (1210 мл) добавляют

сухой сульфат аммония до 70% насыщения. Осадок собирают, растворяют в 150 мл 0,01 М калнйфосфатного буфера с рН 7,4, содержащего 0,001 М А-мер- каптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА, помещают

в диализную трубку и диалнзуют в течение 18 ч против 5 л указанного буфера. Получают 180 мл диализата.

в) Хроматография ЛНК-полимеразы I на колонке с солозой КГ 0/24. Диализат

графии на колонке ( см) с сояозой КГ 0/24, уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора колонку промывают 1000 мл

исходного буфера. Элюирование фермента осуществляют линейным градиентом (3 л) КС1 от 0 до 1,0 М в исходном буфере. Собирают фракции по 20 мл. ДНК-полимераза I элюируется в пределах 0,25-0,30 М КС1. Активные фракции объединяют. Получают 98 MJi ферментного раствора, который диализуют в течение 18 ч против 3 л 0,01 М калий- фосфатного буфера с рН 7,4, содержа«его 0,001 М А-меркаптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА. Получают 100 мл диализата.

г( Хроматография ДНК-полимера,зы I на колонке с CL сефарозой 6В - красно71622393а

коричневый 2К. Диализат ДНК-полимера- Приме г 2. Способ получения зы I E.coli (100 мл) подвергают хро- ДНК-полимеразы I осуществляют анало- матографии на колонке (1, см) с гично примеру 1, однако при хромато- CL сефарозой 6В - красно-коричневый 2К, содержащий 1,4 мкМ красителя в 1 мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора, колонку промывают 100 мл исходного буфера. Элюирование калийфосфат с рН 7,0, 0,0005 М /3-мер- фермента осуществляют линейным гра- каптоэтанола и 0,05 мм ЭДТА. Выход

-графин на колонках с солозой КГ 0/24 CL сефарозой 6R - красно-коричневый 2К, содержащей 1,2 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,005 М

диентом (400 мл) КС1 от 0 до 0,8 М в исходном буфере. Собирают фракции по 8 мл. ДНК-полимераза элюируется в пределах 0,20-0,25 М КС1. Активные фракции объединяют и диалнзуют в течение 18 ч против 2 л 0,01 М калий- фосфатного буфера с рН 7,4, содержащего 0,001 М R-меркаптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА. Получают 40 мл диализа-2Q та.

д) Хроматография ДНК-полимеразы I на колонке с солозой АГ. Диализат фермента (40 мл) подвергают хроматофермента составляет 44% с удельной активностью 15500 ед/мг белка.

Пример 3. Способ получения 15 ДНК-полимеразы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ 0/24, CL сефарозой 6В - красно-коричневый 2К, содержащей 2,4 мкМ красителя/мл сефарозы, ич солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,05 М калийфосфат с рН 8,0, 0,005 М /3-мер- каптоэтанола и 0,5 мМ ЭДТА. Выход фермента составляет 42% с удельной

графии на колонке (1x10 см) с соло- 25 активностью 15000 ед/мг белка.

зой АГ, уравновешенной диализным .буфером. После нанесения ферментного раствора колонку промывают 30 мл исходного буфера, Элюирование фер- - мента осуществляют линейным градиентом (100 мл) КС1 от О до 0,8 М в исходном буфере. Собирают фракции по 2,5 мл. ДНК-полимераэа I элюируется в пределах 0,25-0,3 М КС1. Активные

Пример 4. Способ получения ДНК-полимеразы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ 30 0/24, CL сефарозой 6В - красно-коричневый 2К, содержащей 3 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,1 М калийфосфат с рН 8,5, 0,01 М фракции объединяют и используют для А-меркаптоэтанола и 1 мМ ЭДТА. Вы- концентрирования.ход фермента составляет 35% с уделье) Концентрирование конечного ной активностью 10000 ед/мг белка, препарата. Объединенные фракции (17мл) Пример 5. Способ получения диализуют против 1 л 0,1 N калий- ДНК-полимеразы I осуществляют анало- фосфатного буфера рН 7,4, содержаще- гично примеру 1, однако при хромато- го 0,001 М дитиотрейтола и 507 глице- графии на колонках с солозой КГ 0/24, рина (по объему). Диализ продолжают CL сефарозой 6В - красно-коричневый

2К, содержащей 1 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют

и хранят при . Выход ДНК-поли- 45 исходный буфер, содержащий 0,001 М меразы I составлят 457 с удельной калийфосфат с рН 6,5, 0,0001 М .Р-мер- активностью 16000 ед/мг белка.каптоэтанола и 0,01 мМ ЭДТА, Выход

Активность ДНК-полимеразы I опре- фермента составляет 257 с удельной

в течение 16 ч. Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость

активностью 8000 ед./мг белка.

Результаты представлены в таблиц

Таким образом, преимущество пред лагаемого способа заключается в том что получают высокоочищенный препаделяют по включению в активированную тимусную ДНК (обработанную панкреатической дезоксирибонуклеазой). За единицу активности принимают то количество ДНК-полимеразы I, которое

при 37°С за 30 мин включает 10 няномо- рат с нькодом 457 (по известному лей дезоксирибонуклеозидфосфатов в способу 30%), удельной активностью ДНК-матрииу.

Основным показателем качества ДНК- полимеразы I является отсутствие де- зоксиэндонуклеаэных примесей.

16000 ед./мг белка (по известному способу 8394 ед./мг) и концентрацией фермента 31,8 ед./мкл (по извест ному способу 10 ед./мкл). По сравне

Приме г 2. Способ получения ДНК-полимеразы I осуществляют анало- гично примеру 1, однако при хромато- калийфосфат с рН 7,0, 0,0005 М /3-ме каптоэтанола и 0,05 мм ЭДТА. Выход

-графин на колонках с солозой КГ 0/24 CL сефарозой 6R - красно-коричневый 2К, содержащей 1,2 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,005 М

фермента составляет 44% с удельной активностью 15500 ед/мг белка.

Пример 3. Способ получения ДНК-полимеразы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ 0/24, CL сефарозой 6В - красно-коричневый 2К, содержащей 2,4 мкМ красителя/мл сефарозы, ич солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,05 М калийфосфат с рН 8,0, 0,005 М /3-мер- каптоэтанола и 0,5 мМ ЭДТА. Выход фермента составляет 42% с удельной

активностью 8000 ед./мг белка.

Результаты представлены в таблице.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа заключается в том, что получают высокоочищенный препарат с нькодом 457 (по известному способу 30%), удельной активностью

рат с нькодом 457 (по известному способу 30%), удельной активностью

16000 ед./мг белка (по известному способу 8394 ед./мг) и концентрацией фермента 31,8 ед./мкл (по известному способу 10 ед./мкл). По сравнению с известным способом выход увеличивается в 1,5 раза, удельная активность почти п 2 разя, а концентрация активности более, чем в три раза, Хроматографнческую очистку проводят на отечественных сорбентах.

Формула изобретения

Способ получения ДНК-полимеразы I Escherichia coli, предусматривающий использование продуцента, инифнциро- ванного термомндуцнруемым лизигенным фагом , разрушение клеток, центрифугирование, осаждение фермента и нуклеиновых кислот из экстракта поли мином II, фракционирование сульфатом аммония и обессоливание с последующе очисткой хроматографией с концентрированием конечного продукта, о ТЛИ чающийся тем,что,с целью повыРыход и акт мерачы I

ность ДНК-поли-

шения выхода и удельной активности /фермента, очистку хроматографией осуществляют на колонке с солозой

КГ 0/24 с использованием исходного 0,005-0,05 М калийфосфатного буфера, содержащего 0,0005-0,005 М |&-мер- каптоэтанола и 0,05-0,5 мМ-ом ЭДТА рН 7,0-8,0 и элюции в линейном граO дие нте хлористого калия от 0 до 1,0 М в буферном растворе, затем проводят хроматографию на колонке с CL сефарозой 6R, связанной с лиган- дом-красителем красно-коричневым 2К при соотношении 1,2-2,4 мкМ красителя на 1 мл сефарозы, с использованием того же исходного буфера и элюции в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 0,8 М в буферном растворе, и хроматографию на колонке с солоэой АГ с тем же исходным буфером и в аналогичных условиях элюции.

5

0

)