СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ CU, ZN-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/18 C12N9/02 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицинской промышленности и в лабораторной практике для получения Cu, Zn-супероксиддисмутазы (COД) из эритроцитов человека.

Супероксиддисмутаза находит применение в качестве антиоксидантного протектора при производстве биологических препаратов, используется для защиты от проникающей радиации, как противовоспалительное средство и антимутагенный препарат, находит применение в онкологии и геронтологии, а также в пищевой промышленности.

Известен способ выделения COД из печени крыс [1], включающий гомогенизирование сырья, экстракцию фермента, удаление марганецсодержащей COД, осаждение ацетоном с последующей хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 при pH 7,8 с элюцией ступенчатым градиентом NaCl, причем хроматографию проводят дважды, процесс занимает около 60 ч, достигаемая степень очистки - 250.

Описан также многостадийный способ получения СOД из эритроцитов бычьей крови [2] , включающий отмывку эритроцитов, гемолиз, осаждение гемоглобина смесью этанола и хлороформа, обработку фосфатом калия, обработку ацетоном, двухкратную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-32, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацию на сефадексе G-75 и хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе А-50. Процесс занимает около 120 ч и включает многократное центрифугирование больших объемов. При этом получают электрофоретически гомогенный препарат СОД с выходом 54%.

Недостатками этих способов являются многостадийность, трудоемкость, невысокая степень очистки и получение СОД животного происхождения, антигенно отличной от СОД человека, что может привести к побочным реакциям аллергического характера, это снижает ценность препаратов с точки зрения медицинской практики.

Прототипом настоящего изобретения является способ выделения СOД из эритроцитов человека [3], включающий гемолиз эритроцитов водой, доведение pH до 6,0, добавление до 33% изопропанола, инкубацию 1 ч при 50^oC, охлаждение до 15^oC, фильтрование, концентрирование фильтрата на полых волокнах, охлаждение до О-5^oC добавление 1,5 объемов охлажденного ацетона, перемешивание 3 ч, выдерживание 48 ч, отделение осадка в проточной центрифуге, перерастворение осадка в трис-HCl буфере при pH 7,0, центрифугирование для удаления нерастворимых примесей и хроматографию на поперечно сшитом декстране. Чистота получаемого продукта 87%, выход 20%.

Недостатками способа являются сложность процесса, низкий выход и чистота конечного продукта.

Цель настоящего изобретения - разработка способа получения СОД человека, обладающей высокой удельной активностью, повышение выхода конечного продукта, упрощение процедуры выделения, исключение органических растворителей из процесса. Указанная цель достигается путем термообработки гемолизата при 60-64^oC в течение 10-15 мин, подкисления до pH 5,8-6,3, двухстадийной хроматографии на сорбенте ДЕАЕ-сфераните при сорбции pH 5,7-6,3 с использованием 0,01 М фосфатного буфера и элюции 0,1 М фосфатным буфером при тех же значениях pH и на сорбенте Солоза КГ (товарный знак N 73018) с элюцией при pH 5,1-5,3.

Существенными отличиями являются изменение стадии отделения основных примесей путем замены трудоемкой процедуры предварительной очистки экстракцией органическими растворителями на термообработку гемолизата при температуре 60-64^oC и доочистку фермента с использованием сорбента ДЕАЕ-сферанита, ранее для решения подобных задач не применявшегося.

ДЕАЕ-сферанит - это анионообменный сорбент-сополимер 60% диэтиламиноэтилметакрилата с 40% диметилметакрилатэтиленгликолем [4]. ДЕАЕ-сферанит обладает высокой емкостью, хорошими гидродинамическими свойствами, механической прочностью, что позволяет проводить стерилизацию сорбента, тем самым предпочтительнее других анионитов.

Выбор диапазона температур для обработки гемолизата объясняется тем, что при температуре выше 64^oC и pH 5,7-6,3 наблюдается заметная инактивация СОД, а ниже 60^oC резко уменьшается количество отделяемых примесей (табл. 1)
Проведение хроматографии на ДЕАЕ-сфераните вне указанного диапазона pH приводит к снижению выхода СОД (табл. 2).

Согласно предлагаемому способу к осадку эритроцитов из крови человека добавили два объема дистиллированной воды и прогревали при 60-64^oC 10-15 мин, после чего добавляли 1М раствор соляной кислоты при постоянном перемешивании, в результате чего происходил гемолиз и денатурация основной массы гемоглобина, денатурированные белки отделяли фильтрованием через два слоя капроновой ткани, фильтрат разбавляли в два раза дистиллированной водой и наносили на колонку с ДЕАЕ-сферанитом, уравновешенным 0,01 М фосфатным буфером pH 5,7-6,3. Элюцию СОД проводили 0,1 М фосфатным буфером pH 5,7-6,3. Данная концентрация элюирующего буфера достаточна для полной элюции СОД (табл. 3).

Элюированную с анионита фракцию СОД, подкисленную до значения pH 4,1-4,3, сорбировали на катионите, уравновешенном 0,1М фосфатным буфером pH 4,1-4,3, и после промывки катионита тем же буфером десорбировали СОД в статических условиях при pH 5,1-5,3. Статический способ десорбции позволил получить высокий выход продукта и одновременно полностью отделить его от примесных белков, что исключено при проведении процесса в режиме хроматографии в потоке. Условия сорбции выбраны по экспериментальным данным, приведенным в табл. 4
Конечный продукт обессоливали и лиофильно высушивали. Активность СОД определяли хемилюминесцентным методом [5]. Чистоту получаемого продукта характеризовали с помощью SDS-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии на сорбенте TSK 2000 SW * L.

В результате внесенных изменений в технологию получения СОД человека удалось повысить чистоту продукта с 87 до 98-99%. Выход возрос с 20 до 65-70%. Удельная активность составила 5000000 ед/мг белка.

Дополнительным преимуществом является исключение из процесса органических растворителей, требующих особого соблюдения техники безопасности.

Пример 1. Эритроциты разводят в двух объемах дистиллированной воды. Затем осуществляют термообработку гемолизата при подкислении до pH 6,0, варьируя температуру. Об активности СОД судят по степени подавления хемилюминесценции, выраженной в процентах, в фильтратах, остающихся после отделения осадка. Результаты сведены в табл. 1.

Пример 2. 40 л осадка эритроцитов, оставшегося после отбора лейкоцитарной плазмы, смешивают с 80 л дистиллированной воды и прогревают, перемешивая до 60^oC, добавляют 1400 мл 1М HCl и выдерживают при этой температуре еще 12 мин. Затем содержимое реактора фильтруют через два слоя капроновой ткани в приемную емкость. Общий объем отфильтрованного гемолизата составляет 110 л, его разбавляют дистиллированной водой до 280 л. Значение pH гемолизата при этом составляет 6,3. После охлаждения смеси до комнатной температуры наносят раствор на колонку с ДЕАЕ-сферанитом объемом 15 л, уравновешенным 0,01М фосфатным буфером до pH 6,2. Объем элюированной с колонки 0,1М фосфатным буфером pH 6,3 фракции, содержащей СОД, составляет 37 л. В элюат добавляют 1М HCl до pH 4,2 и наносят его на 4 л Солозы КГ, промывают сорбент 12 л 0,1М фосфатного буфера pH 4,2. Добавляют к катиониту 4 л 0,1М фосфатного буфера pH 4,2 и доводят значение pH суспензии катионита с буфером до 5,25. Перемешивают 1 ч, отделяют раствор десорбированной СОД от катионита. Промывают катионит 6 л 0,1М фосфатного буфера pH 5,2. Объем полученного раствора СОД - 9 л. Раствор СОД концентрируют, обессоливают и лиофилизируют. В результате получают 2,6 г СОД с активностью 500000 ед/мг. Выход от теоретически возможного - 65%.

Пример 3. Операции проводят аналогично приведенным в примере 2. Температура прогрева гемолизата 64^oC. Объем разбавленного фильтра составляет 265 л, pH 6,4. Объем фракции СОД после хроматографии на анионите 39 л, pH десорбции с катионита 5,15. В результате получают 2,76 г СОД с активностью 480000 ед/мг. Выход - 69%.

Пример 4. Операции проводятся аналогично приведенным в примере 2. Подкисление гемолизата осуществляют 2200 мл 1М HCl. Общий объем разбавленного фильтрата составил 240л, а его pH 5,8. Колонку с ДЕАЕ-сферанитом уравновешивают 0,01М фосфатным буфером pH 5,85. Объем фракции СОД после хроматографии на анионите 35 л, объем десорбированной СОД с катионита 6 л. Получают 2,95 г СОД с активностью 500000 ед/мг. Выход - 73%.

Источники информации.

1. Комов В.П. и Иванова Е.Ю. Способ выделения ZN, CU-зависимой супероксиддисмутазы из печени крысы. Авт. свид. СССР, N 979506,1982.

2. Симонян М.А. и Налбандян P.M. Получение электрофоретически гомогенного препарата эритрокупреина и его тепловая денатурация. Биохимия, т. 40, вып. 4, с. 726-732, 1975.

3. Jackson D.E., Manuzza F. J. Isolation of superoxide dismutase. Пат. США, N 4435506, 1984.

4. Гаврюченкова Л. П. , Громова О.А. и др. Анионообменные хроматографические материалы для выделения биологически активных веществ в биотехнологии. Передовой производственный опыт и методы в микробиологической промышленности. M., 1989, с. 18-20.

5. Corbisier P., Houbron A., Remacle J. A new technique for highly sensitive detection of superoxide dismutase activity by chemi luminescence.- Analytical Biochem., v 164, N l, 1987, pp 240-247.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицинской промышленности и в лабораторной практике для получения Сu, Zn-супероксиддисмутазы (СОД) из эритроцитов человека. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта, упрощение способа, исключение органических растворителей. В предлагаемом способе в качестве сырья для получения СОД используют эритроцитарные отходы человеческой крови, которые подвергают гемолизу с одновременной денатурацией основной массы гемоглобина путем прогревания при 60 - 64^oC. Далее осуществляют фильтрацию и очистку СОД-содержащего фильтрата двухстадийной ионообменной хроматографией на анионите ДЕАЕ-сфераните при рН 5,7 - 6,3 с использованием 0,01 М фосфатного буфера с элюцией СОД 0,1М фосфатным буфером при тех же значениях рН и на катионите Солоза КГ с элюцией при рН 5,1 - 5,3. Изобретение позволяет повысить выход целевого продукта до 65 - 70% при чистоте 98 - 99%. 4 табл.

Способ выделения Cu, Zn - супероксиддисмутазы человека путем гемолиза эритроцитсодержащего сырья, прогрева гемолизата, его подкисления и хроматографической очистки, отличающийся тем, что прогрев гемолизата осуществляют при 60 - 64^oC, а хроматографическую очистку супероксиддисмутазы из фильтрата гемолизата проводят сначала на анионите ДЕАЕ при рН 5,7 - 6,3, а затем на карбоксильном катионите при рН 5,1 - 5,3.3