КОНЪЮГАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА С ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ И ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к иммунобиотехнологии, а именно к конъюгатам и иммуносорбентам.

Иммуносорбент может найти применение для диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний.

Известна активированная матрица для иммобилизации белков (Зенюк А.А. и соавторы. Активированная матрица для иммобилизации белков, авт.св. СССР N 1280834, кл. G 01 N 33/50) формулы
П-O-CH₂--CH₂-NH-(CH₂)_n--O-N где П - остаток агарозы, сефадекса или целлюлозы; n=2 или 3 для иммобилизации белков.

Используют полисахаридные матрицы, которые получают в три стадии.

1. Активация полисахаридного носителя эпихлоргидрином.

2. Раскрытие эпоксидного цикла аминокислотой.

3. Этерификация N-оксисукцинимидом карбоксильной группы.

На матрице иммобилизуют белки, содержащие первичную аминогруппу, например, транскортин, сексстероидсвязывающий глобулин, иммуноглобулины.

Однако матрица непригодна для иммобилизации полисахаридных антигенов, так как последний не может связываться с используемым связывающим элементом.

Известен конъюгат, в котором активную группу белкового антигена связывают сульфонирующим или алкилирующим, или ацилирующим агентами (реагент агглютинации и способ его получения, заявка ЕПВ N 280561, кл. G 01 N 33/546).

Однако связывающие агенты пригодны лишь для белковых антигенов, которые зачастую недостаточно специфичны и, следовательно, не позволяют выявить заболевание, что снижает точность диагностики.

Известен также иммуносорбент [1], который выбран в качестве прототипа. Представляет собой конъюгат антиген-полисахарид-протеин. Полисахарид и протеин ковалентно связаны через
-CH₂- -протеин. Низкие агглютинирующие свойства не позволяют использовать его в растворе. Малые адгезионные свойства допускают его использование только с активированными твердофазными носителями. В частности, конъюгат не может использоваться с неактивированными твердофазными носителями, например, из полистирола, поливинилхлорида, полисахарида.

Решаемой задачей является создание конъюгата, обладающего хорошими агглютинирующими свойствами, что позволит использовать его в растворе, и достаточными адгезионными свойствами, что позволит использовать его с неактивированной твердой фазой. Это значительно расширяет область использования конъюгата.

Техническим результатом является то, что альдегидную группировку полисахарида связывают полиэтиленимином.

Сущность изобретения состоит в том, что конъюгат имеет формулу

где n = 10³-10⁶
Из работ, описанных во вводной части описания, известно, что полисахарид используется в качестве антигена и активированного носителя. Использование полиэтиленимина в качестве связывающего звена не известно. Известно лишь использование его в качестве поликатиона для связывания сульфо-, карбокси- и других кислых групп (Haars A., Zonnez S. Hutterma A. Quantitative determination of lignosulfomates from sulfite spend liguors using presipitation with polyethyleneimine. Holzforsch 35(2); 59-65. 81).

Следовательно, налицо изобретательский уровень.

Конъюгат получают следующим образом.

Полисахаридный антиген, например С-полисахарид пневмококка (СПСХ) или А-полисахарид стрептококка гр. А( АПСХ) обрабатывают периодатом натрия, затем добавляют раствор полиэтиленимина. Полная реакционная схема следующая:
1.(C₆H₁₀O₅)_n+ 2 NaIO₄__→(C₆H₆O₃(HO)₂)_n+I₂+4O₂+2Na⁺+2H⁺
2.(C₆H₆O₃(HO)₂)_n+ (C₄H₉N)_n(NH₂)(C₁₀H₁₇O₃)_n+ 2H₂O
Продукт реакции соответствует формуле
где n = 10³-10⁶
П р и м е р. Дозировка ингредиентов приведена в расчете на 1 мг полисахарида. 1.1 мг СПСХ - антигена пневмококка растворяют в 0,1 мл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 8. Добавляют 0,1 мл раствора периодата натрия (2 мг/мл). Инкубируют 1 ч в темноте. Затем добавляют каплю глицерина (для удаления свободного пеиродата натрия) и при энергичном встряхивании вливают 0,45 мл раствора полиэтиленимина, 2 мг/мл (мол.м. 30-40 кДа) на 0,1 М бикарбонатном буфере рН 8. Инкубируют 2 ч.

2. 1 мг группоспецифического полисахарида стрептококка группы А-антигена стрептококка растворяют в 0,1 мл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 8. Добавляют 0,1 мл раствора периодата натрия (2 мг/мл) на бикарбонатном буфере и выдерживают 1 ч в темноте. Для удаления свободного периодата натрия вливают каплю глицерина. Затем добавляют 0,45 мл раствора полиэтиленимина (2 мг/мл) и инкубируют в темноте 2 ч.

Приготовленные таким образом конъюгаты доводят фосфатным буфером до 40 мл и заливают в лунки планшета для иммуноферментного анализа по 100 мкл в каждую. Выдерживают 12 ч при 4^оС, отмывают дистиллированной водой 4 раза и высушивают при 37^оС. После этого материал готов для проведения иммуноферментного анализа.

Поскольку полисахаридный антиген является специфичным для острых инфекционно-воспалительных заболеваний, иммуносорбент пригоден для диагностики этого класса болезней. При этом сорбент с СПСХ - антигеном пневмококка пригоден для диагностики заболеваний, вызванных пневмококком (например острых пневмоний), с АПСХ - антигеном стрептококка группы А - для диагностики заболеваний, вызванных стрептококком группы А (ревматизм, тонзиллит, гломерулонефрит)), с Re- гликолипидом А-антигеном грамотрицательных микроорганизмов - для диагностики заболеваний, вызванных грамотрицательными микроорганизмами - энтеробактериями (пиелонефрит, энтерит, аднексит и т.п.). Для диагностических целей в лунки планшета с конъюгатом вносят по 100 мл 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина на фосфатном буфере, инкубируют 1 ч при 37^оС, после чего удаляют содержимое из лунок и вносят в них по 100 мкл испытуемой сыворотки в разведениях от 1:5 до 1:640. Инкубируют 1 ч при 37^оС, отмывают 4 раза, добавляют в лунки по 100 мкл антител к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:200, выдерживают 1 ч при 37^оС, отмывают 5 раз, вносят по 100 мкл субстрата - ортофенилендиамина (1 мг/мл), рН 4,7, содержащего 0,05% перекись водорода. Выдерживают в темноте 40 мин. Оптическую плотность измеряют при λ =492 нм. В качестве примера приводятся результаты исследования с иммуносорбентом СПСХ пяти больных.

1. Больной С-д, острая пневмония. Из мокроты высеян пневмококк. Титр антител к СПСХ, выявленный с использованием разработанного конъюгата в качестве иммуносорбента, 1:320.

2. Больной Ю-с, острая пневмония, бронхиальная астма. Из мокроты высеян пневмококк. Титр антител к конъюгату с СПСХ, выявленный с использованием предложенного иммуносорбента, 1:640.

3. Больная С-а, туберкулез легких. Титр антител 1:40.

4. Больной Н-о, саркоидоз. Титр антител 1:10.

5. Больной Г-о, хронический бронхит, высеян из мокроты стафилококк. Титр антител к конъюгату с СПСХ, выявленный с использованием разработанного иммуносорбента, 1:20.

Эти примеры показывают, что высокие титры антител наблюдаются у больных в острой фазе заболевания, вызванного пневмококком.

В случае использования сорбента в растворе к 50 мкл суспензии гранул сорбента с носителем добавляют 50 мкл исследуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором от 1:1 до 1:1024, инкубируют не менее 15 мин, реакцию учитывают по образованию цветного осадка.

В качестве примера работоспособности конъюгата приводятся результаты исследований, при которых определяли титр антител известным способом (стандарт) и с использованием предложенного иммуносорбента у пациентов со стрептококковой инфекцией. Результаты приведены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что при использовании стандарта невозможно установить степень достоверности при различной активности процесса, так как данные, полученные с его помощью, не соответствуют состоянию процесса. При использовании предложенного иммуносорбента отмечено высокодостоверное различие по группам больных.

Параллельно проводились исследования титра антител по предложенному изобретению и прототипу. Исследованы сыворотки больных, приведенных в описанных выше примерах. Результаты приведены в табл. 2.

Анализ данных табл. 2 показывает, что сорбент-прототип не пригоден в силу малой молекулярной массы для работы, так как не обладает агглютинирующими свойствами. Предложенный конъюгат можно использовать в качестве иммуносорбента в реакции агглютинации.

Область использования: иммунология, биотехнология. Сущность изобретения: синтетический иммуносорбент, полученный обработкой полисахаридного антигена периодатом натрия и полиэтиленимином, позволяет определять пневмококковые и стрептококковые инфекции. Иммуносорбент имеет мол.м. около 300 млн. дальтон, что позволяет использовать его в тесте агглютинации при выявлении пневмококковых и стрептококковых инфекций. 2 табл.

КОНЪЮГАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА С ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ И ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ.

Конъюгат полисахаридного антигена с полиэтиленимином общей формулы

где n = 10³ - 10⁶,
в качестве иммуносорбента для выявления стрептококковых и пневмококковых инфекций.