Способ диагностики обострения стрептококковой инфекции Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в диагностике заболеваний, вызванных / -гемолитическим стрептококком группы А - ревматизма, тонзиллита, пиелонефрита и гломерулонефрита.

Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа за счет использования стрептолизина О, иммобилизованного на окрашенном носителе.

Способ осуществляют следующим образом.

Из пальца пациента с помощью разового скарификатора берут 0,25 - 0,30 мл крови, которая затем выдерживается в термостате до полного свертывания, центрифугируют кровь в течение 15 мин при 1500 об/мин. Отсасывают надосадочную жидкость и готовят ее разведения в забуференном физиологическом растворе в

соотношениях по объему 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1.10, 1:12, 1:16, 1:20, 1:40, 1:70. В каждую из 11 лунок планшета для иммунологических реакций вносят по 0,15 мл 0,75%-ного раствора визуализированного стрептолизина О в забуференном физиологическом растворе. Затем в первую лунку вливают 0,1 мл забуференного физиологического раствора

-эта лунка служит для контроля за возможной неспецифической агглютинацией (контрольная лунка). Во вторую лунку вносят 0,1 мл сыворотки пациента в разведении 1:2, в третью - 1:4, в четвертую - 1:6, в пятую - 1:8, в шестую - 1:10, в седьмую - 1:12, в восьмую

-1:16, в девятую - 1:20, в десятую - 1:40, в одиннадцатую 1:70. Эти лунки являются опытными, Планшет слегка встряхивают в течение 1 мин и помещают в термостат при 37° на 40 мин, затем вынимают и читают

О

VI о о о о

результаты реакции. Агглютинация во второй лунке, куда была внесена сыворотка пациента в разведении 1:2, соответствует титру антистрептолизина О 1:2, агглютинация в третьей лунке титру 1:4 и т.д. При 5 обследовании предлагаемым способом 30 чел. отработаны количественные критерии (в титрах и в единицах активности антистрептолизина 0-АСЛО) отсутствия и наличия стрептококковой инфекции и степени Ю активности процесса.

Для больных со стрептококковой инфекцией вне обострения характерны титры 1:2 - 1:4(65-125 ед. АСЛО). для больных с умеренной активностью процесса 1:6 - 15 1:8(165-250 ед. АСЛО), а для больных со стрептококковой инфекцией с выраженной активностью от 1:8 и выше (250-625 ед. АСЛО).

Визуализированный препарат получен 20 следующим образом.

За основу для визуализированного препарата взяты гранулы синего декстрена. Навеску синего декстрана в количестве 300 мг растворяют в 10 мл 0,1 М калий фосфатного 25 буфера рН 8,0, добавляют равный объем 40%-ного этанола в 0,1 М калий фосфатном буфере, рН 8,0, содержащего 50 мг бензохи- нона, инкубируют в течение 5 - 8 ч при комнатной температуре с перемешивани- 30 ем. Берут аликвоты по 0,3 мл, Центрифугируют их при 3000 об/мин в течение 15с. При появлении осадка реакцию прекращают добавлением 3 мл 0,5 М натрий ацетатного буфера, рН 3,0. Гранулы осаждают 50%-ным 35 этанолом, осадок промывают 50%-ным этанолом и высушивают в термостате при 37°С. Размер гранул не превышал 2 мкм. Гранулы декстрана растворяют в 0,1 М калий фосфатном буфере рН 8,0, содержащем стрептоли- 40 зин О в концентрации 5 мг/мл ( 1 ч. стрептолизина О на 5 ч. гранул декстрана). Смесь инкубируют 16 ч при комнатной температуре с перемешиванием, затем блокируют сводобные остатки бензохинона 45 яичным альбумином в концентрации 5 мг/мл и глицином в концентрации 5 мг/мл.

Гранулы осаждают 50%-ным этанолом и после промывки 50%-ным этанолом перево- 50 дят в забуференный физиологический раствор. В растворе гранулы сохраняют стабильность в течение 3 - 4 недель при 4°С. При хранении к взвеси добавляют азид натрия.55

Таким образом единожды приготовленный визуализированный стрептолизин О можно использовать в течение 1 мес.

П р и м е р 1. Больная Т. (3 детская больница). Кровь на анализ по предлагаемому способу взята 25.09.87. Хронический тонзиллит, гноя нет, яркой картины активного процесса нет, однако из зева высеян стрептококк. Поэтому процесс расценивался как активный. Результат обследования по предлагаемому способу - титр 1:8.

П р и м е р 2. Больная К. (3 детская больница). Кровь взята на анализ 23.09.87. Хронический декомпенсированный тонзиллит, гной, температура субфибрильная. Активный процесс. Титр 1:20.

П р и м е р 3. Больная С. (3 детская больница). Кровь взята на анализ по предлагаемому способу 08.09.87. Ревматизм III ст. активности. Титр 1:10.

П р и м е р 4, Больной Б. (3 детская больница). Кровь взята на анализ 29.09.87. Хронический тонзиллит, аденоиды. Выраженных проявлений активности нет. Больной лечился в течение 18 дней. Результат по предлагаемому способу - титр 1:8.

П р и м е р 5. Больной Б. (3 детская больница). Кровь взята на анализ 18.09.87. Ревматизм О ст. (вне обострения). Титр 1:4.

П р и м е р 6. Больная С., диагноз ревматизм III ст. активности. При использовании 0,75% визуализированного стрептолизина О агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки 1:10, при использовании визуализированного стрептолизина О в концентрации 0,50% агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки 1:8. Таким образом, при использовании концентрации визуализированного стрептолизина О меньше 0,75% чувствительность способа падает.

При концентрации стрептолизина О,визуализированного с помощью декстрана - 1,00%, чувствительность способа диагностики не возрастает.

П р и м е р 7. Больная С., ревматизм III ст. активности. При использовании визуализированного стрептолизина О в концентрации 1,00% агглютинация отмечена в лунке с разведением сыворотки 1:10, что отмечается и при использовании визуализированного стрептолизина О в концентрации 0,75%. При концентрации 1,50% t(вдвое большей предлагаемой в способе) результаты агглютинации трудно учитывать из-за высокой концентрации визуализированного стрепто- лизина О.

Таким образом, оптимальной является концентрация визуализированного стрептолизина 0 - 0,75%.

П р и м е р 8. Больная С., диагноз - ревматизм III ст. активности. При инкубации в течение 35 - 40 мин агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки

1:10. При инкубации материала в течение 25 мин агглютинация не отмечается ни в одной из лунок.

При инкубации материала 1 - 2 ч агглютинация отмечена в лунке с разведением сыворотки 1:10. При инкубации материала в течение 3 - 4 ч картина агглютинации также не меняется.

Таким образом время инкубации 35 - 40 мин является оптимальным.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа состоит в следующем.

Повышается доступность способа для клиник (а не только для единичных диагно- стических центров) в связи с исключением использования взвеси эритроцитов человека или кролика, приготовляемой о день постановки реакции.

Для определения стрептококковой ин- фекции по прототипу требуется не менее 0,5 мл крови пациента. Ее забираюг из вены или пальца пациента, причем на практике обычно из вены. Забор крови из вены при отсутствии одноразовой иглы со- здать угрозу инфицирования пациента. В предлагаемом способе кровь забирают только из пальца пациента разовым скарификатором, поэтому предлагаемый способ более безопасен. .

Предлагаемый способ является менее времяемким по сравнению с прототипом. На операции, общие для обоих способов, в прототипе требуется 4 - 28 ч, а в предлагаемом способе 1 ч 10 мин, а с учетом пассив- ных затрат времени на инкубацию растворов при приготовлении визуализированного стрептолизина О менее 2 ч.

Повышение точности способа подтверждается следующими примерами.

Больной А., 12 лет. 3 ДКБ, г. Новосибирск. Хронический декомпенсированный тонзиллит, обострение. Анализ от 15.05.87. АСЛО - 165 ед. Предлагаемый способ - 1:8 (250 ед.).

Анализ по прототипу (165 ед. АСЛО) соответствует состоянию вне обострения или умеренная активность процесса. Анализ по предлагаемому способу показал более высокое содержание антистрептолизина О (250 ед. АСЛО), что соответствует состоянию между умеренным и активным процессом. У ребенка хронический декомпенсированный тонзиллит в стадии обострения. Предлагаемый способ диагностики точнее отразил реальное состояние больного.

Больной 3, 11 лет. 3 ДКБ, г. Новосибирск. Ревматизм I ст., активная фаза, миокардит активность I - II ст.Анализ от 24. 04. 87. АСЛО-250 ед.Предлагаемый способ 1:10 (313 ед.). Анализ от 24.04.87. АСЛО - 250 ед. Предлагаемый способ 1:10 (313 ед.).

Анализ по прототипу дает представление об активности процесса, но в анализе по предлагаемому способу цифры выше.

Больной 3., 14 лет. 3 ДКБ. г. Новосибирск. Полиартрит вирусной этиологии, ОРЗ. Анализ от 15.05.87. АСЛО - 250 ед. Предлагаемый способ - 1:2 (65 ед.).

У больного 3. нет стрептококковой инфек ции (у него полиартрит вирусной этиологии), что и отражает анализ по предлагаемому способу. Анализ по прототипу ошибочно показывает наличие стептококковой инфекции,

Больной 3., 11 лет. 3 ДКБ. г. Новосибирск. Хронический тонзиллит после лечения, вне обострения. Анализ от 20.05.87. АСЛО - 65 ед. Предлагаемый способ - 1:2 (65 ед.). Анализы по обоим способам совпадают и верно отражают состояние больного.

Показатели диагностики стрептококковой инфекции при использовании прототипа и предложеного способа представлены в таблице.

Формула изобретения

Способ диагностики обострения стрептококковой инфекции путем выявления антител к стрептолизину О в реакции агглютинации, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, к сыворотке больного добавляют 0,75% стрептолизинО, иммобилизованный на окрашенном носителе, затем термоста- тируют в течение 35 - 40 мин, учитывают результаты реакции и при значении титра антител 1:8 - 1:20, диагностируют обострение стрептококковой инфекции.

Группы обследованных

АСЛО (ед.)

Титр антител по предлагаемому способу Mtm мин-макс

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике заболеваний, вызванных β-гемолитическим стрептококком группы А - ревматизма, тонзиллита, пиелонефрита и гломерулонефрита. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа. Для этого из пальца пациента берут 0,25 - 0,30 мл крови и отделяют сыворотку. Готовят ее разведение в забуференном физиологическом растворе в соотношениях по объему 1 : 2, 1 : 4, 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10, 1 : 12, 1 : 16, 1 : 20, 1 : 40, 1 :70 и добавляют по 0,1 мл полученных растворов в лунки иммунологического планшета, в которые предварительно внесено по 0,15 мл 0,75%-ного раствора визуализированного стрептолизина 0 в забуференном физиологическом растворе. Планшет слегка встряхивают, инкубируют 40 мин при 37°С, затем читают результаты реакции. Способ позволяет сократить время исследования до 1 - 2 ч, повысить точность способа за счет повышения чувствительности, исключить необходимость забора крови из вены больного.

Больные со стрептокоКко вой инфекцией, активный процесс (ревматизм I активная фаза,, активность III ст., обострение хр. тонзиллита) - 22 чел. до лечения

Больные со стрептокок- ковой инфекцией, в процессе лечения - 22 чел

Больные стрептококковой инфекцией вне обострения - 22 чел.

1:12,0 t1,2 (1:8-1:20) bt 0,001

х

1:6,A to,A (1:6-1:8) Pf.s 40,001

1:3,350,4 (1:2-1:4) РМ 0,001

Имеют место достоверные различия между группами 1-2, 2-3, 1-3.