АНТИГЕН ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ СРЕДИ БЕРЕМЕННЫХ ГРУПП РИСКА ПО РАЗВИТИЮ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Оно может быть использовано для выявления среди беременных групп риска по развитию патологии у детей, или, иными словами, для прогнозирования развития патологии у детей после их рождения.

Известно применение антигенов у новорожденных (дети в возрасте до 28 дней) и у детей более старшего возраста с диагностической целью (А.И.Аутеншлюс и соавт. Критерии лабораторной диагностики бактериальных инфекций и токсоплазмоза у новорожденных и детей раннего возраста. Новосибирск, 1994).

Известно также применение антигенов при обследовании беременных, позволяющее прогнозировать развитие той или иной патологии у ребенка после рождения. Например, применение токсоплазменного антигена при анализе крови беременной позволяет прогнозировать развитие токсоплазмоза у ребенка (там же. с. 82-97). Выявление и отнесение беременной к группе риска обусловливает своевременную терапию и позволяет предупредить рождение ребенка с токсоплазмозом.

Достоинство и одновременно ограниченность (недостаток) этих решений состоит в том, что, применяя конкретный антиген, можно прогнозировать развитие только конкретной патологии. Нет одного антигена, применение которого в обследовании беременной дало бы возможность прогнозировать развитие нескольких патологий различных органов и систем у детей.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению являются применение органных и тканевых антигенов при обследовании беременных для прогнозирования развития патологии в соответствующих органах и тканях у детей, например в легких и в ткани мозга (А.И.Аутеншлюс и соавт. Бактериальная и тканевая сенсибилизация у беременных и их детей. Вопросы охраны материнства и детства. 1991. N 5, c. 41-44). Применение указанных в работе антигенов позволяет прогнозировать патологические процессы в тех органах и тканях, антиген которых применялся при обследовании.

Предлагаемое изобретение позволяет расширить диапазон прогнозируемых патологий у детей. Причем на основании обследования беременной женщины оказывается возможным прогнозирование патологических состояний не только у новорожденных, т.е. у детей в возрасте до 28 дней, но и у детей в более позднем возрасте. Предлагаемое изобретение, таким образом, позволяет выявлять и формировать группу риска среди беременных по развитию патологии у детей с ранних сроков беременности, что дает возможность своевременно проводить коррегирующую терапию в этим предупредить рождение детей с патологией.

Предложенный для применения антиген является гликопротеином Bacillus megaterium H, он применялся ранее для выявления антител в сыворотке крови больных с онкологической и неонкологической патологией (Д.Г.Затула, В.А.Семерников Иммунология перекрестно реагирующих антигенов микроорганизмов и клеток бластом. Киев. 1986. А.И.Аутеншлюс и соавт. Антитела к гликопротеину Bacillus megaterium H. у больных с онкологической и неонкологической патологией желудочно-кишечного тракта. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1994, N 5, с. 520-522). В последнем источнике указано применение, в частности, фракции гликопротеина с мол. массой 15-18 кД для диагностических целей у больных с онкологическими и неонкологическими заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

Задачей заявляемого изобретения является формирование среди беременных групп риска по развитию патологии у детей.

Поставленная задача решается применением гликопротеина почвенного сапрофитного микроорганизма Bacillus megaterium H. с мол. массой 18 кД, впервые предлагаемого в качестве антигена для формирования среди беременных групп риска по развитию патологии у детей.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в сыворотке крови беременных женщин определяют антитела-иммуноглобулины G к гликопротеину Bacillus megaterium H с мол. массой 18 кД.

Получение антигена и его характеристика
Культуральную жидкость 3-суточной культуры Bacillus megaterium H. очищают от микробных тел и детрита путем центрифугирования при 5000 об/мин, 20 мин. К полученному объему супернатанта культуральной жидкости добавляют 3 объема этанола -96^oС. Смесь инкубируют при 4^oС в течение 2-х суток, после чего выпавший осадок собирают центрифугированием смеси при 5000 об/мин, 10 мин лиофилизируют. Лиофилизированный осадок подвергают гельфильтрации на TSK-CEZ Tojoperl марки HW-55. Колонку диаметром 1,5 см и длиной 80 см заполняют этим гелем в количестве 170 мл. Для получения гликопротеина используют 400 мг лиофилизированного осадка, который растворяют в 1,5 мл фосфатного буфера, pH 7,4. Указанный объем растворенного осадка наносят на колонку, после этого через колонку пропускают фосфатный буфер - pH 7,4 со скоростью 1,2 мл/мин. Идентификацию полученных фракций проводят автоматически на проточном спектрофотометре при длине волны 260 нм. Пробы собирают в коллектор фракций в объеме 5 мл. Идентифицируют по хроматограмме фракцию (по пику) с мол. массой 18 кД, собирают и концентрируют с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ-40) до объема 5 мл. Полученную фракцию лиофилизируют и используют для иммуноанализа.

Эту фракцию подвергают изофокусировке в амфолиновых буферах с градиентом pH 3-10. После окончания фокусировки пластины геля окрашивают Кумасси-голубым (индикатор на протеин) и Шифф-реактивом (индикатор на углеводы). Оба реагента в зоне pH 3,8-4,2 выявляют гомогенное вещество, которое окрашивается Кумасси-голубым и Шиф-реактивом. Следовательно выделенная фракция является гликопротеином с мол. массой 18 кД.

Технология применения предлагаемого антигена
В лунки планшета для иммуноферментного анализа вносят 100 мкл раствора антигена в карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,0 в концентрации 300 мкг в мл. Оставляют раствор в лунках на 18 ч при 4^oС, после чего раствор гликопротеина удаляют из лунок планшета, отмывают их дважды забуференным физиологическим раствором с 0,05% твин-21 или тритон X-100, затем вносят 5%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина в забуференном физиологическом растворе и помещают планшет в термостат при 37^oС, затем содержимое извлекают из лунок и вносят сыворотку крови пациентов и серонегативную контрольную сыворотку в разведении 1:50. Планшет выдерживают при 37^oС 1 ч, после чего удаляют сыворотки из лунок, планшет 3-кратно отмывают забуференным физиологическим раствором с детергентом и вносят антитела, меченные пероксидазой хрена против иммуноглобулинов G человека. Планшет помещают на 1 ч в термостат при 37^oС, затем удаляют содержимое из лунок, 3-кратно промывают забуференным физиологическим раствором с детергентом, после чего вносят в лунки по 100 мкл субстрата (10 мг ортофенилендиамина растворяют в 1 мл метанола и доводят до 100 мл цитратным буфером pH 4,7; непосредственно перед внесением в лунки в раствор добавляют 33%-ную перекись водорода из расчета 20 мкл на 10 мл раствора). Планшет помещают в темное место до появления желтой окраски. Реакцию останавливают добавлением в лунки 100 мкл 1 М серной кислоты. Определяют плотность полученного продукта реакции в каждой лунке при 492 нм. Данные иммуноферментного анализа выражают в виде коэффициента K= D_o/D_к, где D_о-оптическая плотность продукта реакции сыворотки пациента, D_к - оптическая плотность продукта реакции серонегативной контрольной сыворотки. Уровень антител считается повышенным при K ≥ 1,20, т.е. на 20% и более превышающий уровень антител в серонегативной контрольной сыворотке.

Приводим таблицу, в которой представлены данные по уровню антител к предлагаемому антигену у беременных женщин, родивших здоровых детей и детей с патологией (^ххх - степень достоверности различий со здоровыми беременными женщинами, родившими здоровых детей р < 0,001).

Из таблицы видно, что у беременных женщин, родивших детей с патологическими процессами, уровни антител (АТ)-иммуноглобулинов к предложенному антигену более чем на 20% (K > 1,20) превышают уровни АТ как в серонегативной контрольной сыворотке, так и у беременных женщин, родивших здоровых детей.

Приводим конкретные примеры обследования беременных женщин с предлагаемым антигеном:
1. Беременная X-o, 26 лет. 1 обследование в 6-7 недель беременности, на момент обследования соматически здорова, K=0,76. 11 обследование в 25-26 недель, K= 1,25. На момент второго обследования у женщины отмечалась угроза прерывания беременности, предгестоз. III обследование в 37-38 недель беременности, K= 2,12. У женщины отмечен поздний гестоз, отечный вариант средней тяжести. Ребенок родился c пренатальной гипотрофией II степени с пренатальным поражением нервной системы в форме спастического тетрапареза, гипертензионно-гидроцефального синдрома.

2. Беременная Я-а, 23 года. 1 обследование в 7-8 недель, K=1,17. На момента 1 обследования соматически здорова. II обследование в 20-22 недели, K= 0,97. Беременность протекает физиологически. III обследование в 32-33 недели, K=0,99. Женщина здорова, беременность протекает физиологически. Родился здоровый ребенок.

Таким образом применение гликопротеина Bacillus megaterium H. в качестве антигена позволяет формировать среди беременных группы риска по развитию патологии у их детей.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления среди беременных групп риска по развитию патологии у детей или для прогнозирования развития патологии у детей после их рождения. Задача изобретения заключается в формировании среди беременных групп риска по развитию патологии у детей. Сущность изобретения состоит в применении гликопротеина Bacillus megaterium H. с мол. м. 18 кД в качестве антигена в иммуноферментном анализе для выявления антител в сыворотке крови беременных для формирования групп риска по развитию патологии у детей. Преимущество изобретения заключается в возможности прогнозирования у беременных развития нескольких патологий различных органов и систем у детей. 1 табл.

Применение гликопротеина Bacillus megaterium H. с мол.м. 18 кД в качестве антигена в иммуноферментном анализе для выявления антител в сыворотке крови беременных для формирования групп риска по развитию патологии у детей.