Способ определения антигенов микобактерий в крови больных туберкулезом Советский патент 1992 года по МПК A61K39/00 

pa рН 2,О-2,A, который добавляли к испытуемой сыворотке крови (1:1), После инкубации в течение 30 мин пр образцы наслаивали на колонку и уравновешивали этим же буфером. Дальнейшее разделение проводили путем гель-фильтрации на сефадексе G-200. Элю,ацию проводят этим же 0,2 М г.лицин-НС1-буфером. Собирают фракцию (по 1 мл) и после нейтрализации бикарбонатом натрия каждую из собранных фракций исследуют на содержание бактериального антигена в реакции агрегатагглютинации, а затем вычисляют суммарный титр анти гена (по всем пробам). При .постановке реакции агрегатаг глютинации сыворо,тку больного (там, где ищут антиген) добавляют к взвеси эритроцитов, обработанных глютаральдегидом (ГЛА) и агрегированной иммунной сывороткой против микробов-возбудителей болезней легких. В этой реакции при определений антигенов используют эритроциты человека 0(1)группы Rh-.Эритроциты, отмытые от сывороточных белков и .консерванта физиологическим раствором рН (до полного отсутствия реакции ha белок с 50 ной трихлоруксусной кислотой в промывной жидкости), суспендируют в двукратном объеме физиологического раствора и добавляют к ним раствор ГЛА. После трехчасовой инкубации при 37° эритроциты отмывают k раза физиологическим раствор ресуспендируют в нем же и вновь добавляют ГЛА до 0, концентрации (для хранения в активированном состоянии). Для агрегации на эритро цитах отбирают сыворотки, полученные иммунизацией кроликов убитой культурой каждого из микробов: пнев мококка (l, II и111 серотипов) патогенного стафилококка и гемолитического стрептококка, разрушенной культурой живых микобактерий БЦЖ, которые со своим специфическим антигеном в реакции преципитации давали титр не менее 1:18, Для поли конденсации к 1 мл этой сыворотки добавляют 0,08 мл 1,5 -ного раство ра ГЛА на физиологическом растворе и инкубируют в течение 1 ч при 1 мл взвеси стабилизированных эритроцитов после отмывания физиологическим раствором от ГЛА смешивают с 1 мг агрегированной сыворотки, внося навеску бикарбоната натрия до 2%-ной конечной концентрации. Смесь инкубируют 90 мин при , после чего сенсибилизированные эритроциты, отмывают трижды физиологическим раствором, ресуспендируют в 10 мл физиологического раствора, добавляют мертиолат 1:10000 и хранят при с до использования. Постановку реакции агрегатагглютинации проводят в агглютинационных дисках микротитратора Такачи на 0,2%-ной нормальной кроличьей сыворотке. Ее результаты учитывают после добавления к сыворотке больного сенсибилизированных эритроцитов и инкубации в течение 3ч при 37С, Исключение любого из вышеуказанных приемов не позволит получйть ми-кобактериальные антигены. Изменение вышеуказанных приемов, например замена глицин-.НС1-буфера на фосфатный, изменение полной силы буфера, изменение рН буфера S кислую или щелочную сторону, использование сефадекса с другими размерами частиц, изменение условий и температуры, контакта сыворотки крови с глицин-НС1-буфером, количества полученных проб, не позволяет получить или приводит к резкому снижению количества получаемых вэлюате микобактериальных антигенов, как показано в табл,-. Следовательно, наиболее оптимальным является рН 2,0 и до 2,, Использование колонки размером см является достаточным для хроматографии 0,5 мл сыворотки. Пример 1, Больной К-в поступил в отделение дифференциальной диагностики с подозрением на туберкулез легких, У больного взято 2,5мл крови для исследования, из которой общепринятым способом получают сыворотку (1,0 мл). При постановке комплекса иммунологических тестов не обнаружено противотуберкулезных антител. Титр антигена в сыворотке при постановке реакции агрегатагглютинации с эритроцитами, обработанными иммунной сывороткой против микобактерий туберкулеза, 1:8 (ниже диагностического титра реакции 1:32), У больного, не обнаружено антигенов

стрепто-, стафило- и пневмококка. Произведена диссоциация иммунных комплексов в сыворотке. К 1 мл испытуемой сыворотки крови добавляют 1 мл 0,2 М глицин-НС1-буфера рН 2, и инкубируют 30 мин при для разрушения иммунных комплексов. Дальнейшее разделение разрушенных иммунных комплексов проводят на колонке 25Qf10 мм с сефадексом G-200. Для этого сыворотку с глицин-НС1-буфером после инкубации (1:1) наслаивают на колонку и уравновешивают тем же буфером. После того как испытуемая сыворотка прошлв через колонку, ее элюируют этим же глицин-НС1-буфером в количестве 12 образцов (фракций), каждая объемом 1 мл. Таким образом, из 1 мл испытуемой цельной сыворотки получают 12 фракций.

Для определения содержания в каждой фракции бактериального белка в РАГ необходимо нейтрализовать их бикарбонатом натрия до нейтрального рН Затем определяют конечный титр реакции на бактериальный белок в каждой из 12 фракций испытуемой сыворотки. Складывают показатели в каждой фракции и получают суммарный титр содержания антигена RO .всем фракциям (пробиркам).

Поскольку вначале сыворотку разводят в два раза глицин-НС1-буфером, суммарный титр удваивают и получают таким образом окончательный ответ о содержании бактериального антигена в сыворотке больного путем разрушения специфических циркулирующих иммунных комплексов.

Постановку реакции агрегатагглютинации проводят в агглютинационных досках микротитратора Такачи на 0,2%-ной кроличьей сыворотке. Фракции разводят 1й, 1:8, 1:16, 1:32, 1:6ij и т.д. Далее к ним добавляют обработанные глютаровым альдегидом и специфической иммунной сывороткой против разрушенных микобактерий веж (титр сыворотки в реакции преципитации 1:16) эритроциты и инкубируют в течение 1 ч при 37С, после чего учитывают результат реакции Титр антигена при постановке реакции агрегатагглютинации с иммунной сывороткой против микобактерий туберкулеза после диссоциации иммунных комплексой у больного повысился до 1:128, антигены стрепто-, стафило- и пневмококков у него по-прежнему не обнаруживались. В дальнейшем при обследовании и по результатам лечения диагноз туберкулеза у данного больного был подтвержден. Таким образом, в данном случае путем диссоциации иммунных комплексов у больного в сыворотке обнаружены антигены микобактерий, что является прямым указанием на инфицирование микобактериями туберкулеза. Следовательно, уже в период поступления в стационар, когда диагноз туберкулеза был неясен, было получено указание на этиологию заболевания.

Пример 2. Больная Б. поступила в диагностическое отделение с диагнозом: обострение простого (катарального) бронхита, а больной Д. - с диагнозом: обострение хронического обструктивного бронхита. При обследовании мокроты у больной ,Б. был выделен пневмококк, а у боль1ного Д. посев оказался стерильным. При первом иммунологическом обследовании не было выявлено никаких антител в обоих случаях. Методом прототипа - РАГ - у больного Б. были зарегистрированы свободные антигены патогенного стафилококка и пневмококка в титрах 1:18. При диссоциации ЦИК титры этих антигенов возросли соответственно 1:96 (в 6 раз) и 1:1 (в 9 раз). Это дало основание предположить, что к пневмококку в процессе обострения присоединился патогенный стафилококк. После прове.денной антибактериальной TepanviH наступила ремиссия болезни с полной ликвидацией антигенов стафилококка и пневмококка иа крови как свободных так и из ЦИК.

У больного Д. при обострении обструктивного бронхита были также обнаружены свободные антигены патогенного стафилококка и пневмококка в крови в титрах 1:1б и 1: 8, причем слаба выражен последний. При диссоциации ЦИК титр стафилококкового антигена увеличился в четыре разе (1:6), а титр пневмококкового ан- . тигена был 1:1б, ниже диагностического титра для антигенов из ЦИК (1:32)о Это дало возможность сделать заключение о ведущей роли в данном обострении патогенного стафилококка , а- пневмококк в настоящий момент не участвовал как этиологический фактор, так как имелись лишь его следы в крови, В результате проведенной антибактериальной терапии в стадии ремиссии у данного больного свободные антигены отсутствовали, а антигены стафилококка из ЦИК были зарегистрированы в титре 1:32 (диагностический титр), антигены пневмококка как и прежде в титре 1:16 отсутствуют. Необходимо отметить, что если при ремиссии простого бронхита антигены сразу же исчезают из крови, то в стадии ремиссии обструктивного бронхита антигены в ЦИК могут определяться длительно, до k-() месяцев, указывая на этиологический фактор заболевания. Необходимо указать и на прогностическое значение определения антигенов из ЦИК, особенно в процессе лечения, при длительных, хронически текущих заболеваниях легких. Наблюдалась, например, группа больных фиброзно-кавернозным туберкулезом в фазе распада, впервые выявленного При активном лечении свободные ант гены из крови, как правило, исчезаю У больных с плохой кпинико-рентгено логимеской 41инамикой или со стабилизацией туберкулезного процесса антигены из ЦИК есть всегда и в бол ших титрах, часто при отсутствии свободных антигенов. В то же время .группе больных с хорошей клинико рентгенологической динамикой при по ном заживлении каверны происходит полная элиминация туберкулезных антигенов из крови. В ЦНИИ туберкулеза Минздрава ССС обследованы больные туберкулезом, главным инфильтративным с распадом и фиброзно-кавернозным в ст дии обострения (53 чел.), хроническ ми пневмониями и бронхитами (66 чел Результаты исследований представ лены в табл.5. В результате диссоциации иммунны комплексов у 48 человек (из 53 обсл дованных больных туберкулезом) выяв лены туберкулезные антигены в титре выше установленного нами на здоровы лицах диагностического титра (1:32). У 23 человек, у которых обнаруживались и свободно циркулирующие туб кулезные антигены в крови, титры возросли в раза (у 25 больных до диссоциации антигены в крови вовсе не выявлялись). В среднем чувствительность метода возросла в 10 раз. У больных хроническими пневмониями и бронхитами также в 10 раз возросла чувствительность реакции при определении пневмококковых антигенов (при диагностическом титре 1:25), почти в 9 раз - при определении антигенов гемолитического стрептококка (диагностический титр 1:32), в 7 раз при определении антигенов патогенного стафилококка (при диагностическом титре 1;32). I Таким образом, преимущество предлагаемого способа заключается в определении антигенов никобактерий туберкулеза в сыворотках больных, в которых они не определялись. Число таких больных возросло в зависимости от формы болезни в 1,7-3,2 раза, в увеличении титров бактериальных антигенов, что повысило чувствительность реакции по сравнению с прототипом в 7-19 раз; проведение эффективной противотуберкулезной или антибактериальной терапии в ряде случаев снижало титры антигенов в ЦИК, а при полном обратном развитии туберкулезного процесса или ремиссии хронических заболеваний легких (ХНЗЛ) они вообще не определялись. Это свидетельствует о прогностическом знамении определения антигенов из ЦИК, обнаружение из ЦИК антигенов пневмококка, стафилококка или гемолитического стрептококка при хронических заболеваниях легких позволило более точно оп{: еделить этиологический фактор заболевания, являющийся непосредственным возбудителем заболевания или обострения ХНЗЛ самостоятельно или в ассоциации с другими микробами. Следовательно, определение бактериальных антигенов из ЦИК повышает эффективность диагностики всопалительных заболеваний легких, которая заключается в уточнении диагноза заболевания, особенно в тех случаях; когда показатели других иммунологических тестов, находятся в пределах нормы.

91123128

Таблица 1

Получение микобактериальных антигенов в титрах при изменении рН глицин-НС1-буфера 0,2 М 5, в сыворотке больного туберкулезом М

10 Таблица 3

Выход микобактериальных антигенов при изменении температуры контакта сыворотки больного с глицин-НС1-буфером

Таблица 2

Получение микобактериальных антигенов в титрах при изменении ионной силы глицин-НС1-буфера при рН 2,0 контакта и размеров частиц сефадекса и числа проб в элюате в сыворотке больного туберкулезом М

Таблица,, Выход микобатериальных анти 11

12 ;

1123128

Продолжение табл.5