СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА DRECHSLERA ROSTRATA (DRECHSLER)RICHARDSON ET FRASER Российский патент 1995 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологии, а в частности к способам культивирования микромицетов, используемых для оценки биостойкости металлов, защищенных консервационными смазочными материалами в тропических условиях Республики Куба.

Известны способы культивирования микромицетов-продуцентов белково-ферментного комплекса [1] и предусматривающих увеличение выхода биомассы [2].

Недостатком этих способов выращивания мицелиальных грибов является то, что в качестве источника углерода используется льняная костра или отходы хлопчатника, на которых не растут штаммы грибов-деструкторов металлов, покрытых консервационными смазочными материалами.

Известны также традиционные питательные среды (Чапека, сусло-агар), рекомендованные ГОСТ 9.052-88 [3] для выращивания микромицетов-деструкторов масел и смазок. На этих средах хорошо растут штаммы низших грибов, используемых в качестве тест-культур для испытаний алюминиевых сплавов на грибостойкость, а также некоторые штаммы микромицетов, используемых для определения микологической стойкости технических масел, применяемых в тропическом климате.

При высеве на них продуктов коррозии металлов, защищенных консервационными смазочными материалами, которые экспонировались на Кубе длительное время, для обнаружения микроскопических грибов, они способствуют только вегетативному росту изолятов, относящихся к роду Drechslera. Состав этих сред не обеспечивает появления конидиальной стадии у грибов этого рода.

Цель изобретения - расширение возможности способа культивирования гриба с достижением эффекта спороношения для дальнейшей его идентификации.

Цель достигается тем, что для образования спороношения тропических мицелиальных грибов из рода Drechslera - деструкторов металлов, защищенных консервационными смазочными материалами, используют твердую подложку, на поверхность которой наносят тонкий слой противокорpозионной присадки Акор-1. В качестве твердой подложки используют предметное стекло или металлические пластины, которые тщательно промывают в воде, обезжиривают венской известью, протирая по поверхности пластины щеточкой под струей водопроводной воды, высушивают, стерилизуют в пламени горелки и после охлаждения опускают на 1 ч в стерильный раствор присадки Акор-1. По истечении 1 ч пластины вынимают и в подвешенном состоянии дают стечь Акору-1 в течение 2-4 ч, поместив пластины в подвешенном состоянии на держателе в стерильную поллитровую банку. По истечении заданного времени (после формирования масляной защитной пленки) подготовленные к испытаниям пластины размещают на поверхности суточного грибного газона в чашках Петри с питательной средой сусло-агар. Через 9, 14, 21 сут наблюдают за спороношением гриба на поверхности пластины, покрытой присадкой Акор-1. Акор-1 используют в качестве субстрата, благоприятного для роста изолятов грибов, деструктирующих консервационные смазочные материалы. Присадка Акор-1 изготовляется на основе селективно-очищенного нитрованного масла АС-9,5 из сернистых нефтей с добавлением при защелачивании 10+1% технического стеарина. Масло АС-9,5 имеет следующую характеристику: молекулярная масс 436; плотность (г/см³) 0,88; вязкость при 100^оС (мм²/с) 9,5; индекс вязкости 85; температура застывания 15^оС; температура вспышки 200^оС. Групповой химический состав: 50,79% парафино-нафтеновых углеводородов, а остальные ароматически, из которых бензольных 18,20% . многоядерных 17,09%, сернистых соединений 12,97%, смол 0,95%. Для получения штамма Drechslera rostrata (Drechsler) Richardson et Fraser BKMF-3188Д была исследована микрофлора продуктов коррозии металлических образцов из алюминиевых сплавов, защищенных консервационными смазочными материалами, проходившими натурные испытания в течение 16 мес в тропических условиях Республики Куба. Из различных образцов алюминиевых сплавов, защищенных консервационными составами, прокорродировавших в результате натурных испытаний в Республике Куба, была выделены различные микромицеты. Наиболее часто в продуктах коррозии алюминиевых сплавов, защищенных смазочными составами, встречался гриб Drechslera rostrata (Drechsler) Richardson et Fraser. Из 37 образцов указанный гриб был обнаружен в продуктах коррозии 28 образцов. Наиболее агрессивным по отношению к сплаву Д16, защищенному присадкой Акор-1, оказался предлагаемый штамм Drechslera rostrata (Drechsler) Richardson et Fraser - N III. После 9 мес испытаний алюминиевого сплава Д16, защищенного присадкой Акор-1, на коррозию под действием этого штамма гриба потеря массы металла составляла 8,5%, а глубина коррозионных язв составляла 2,5 мм.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМF-3188Д.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Штамм гриба через неделю роста на среде сусло-агар при 25^оС образует колонии диаметром 8-8,5 см от темно-серого до черного цвета. Обратная сторона колоний черная. Гифы гриба толстые, от бесцветных до бледно-коричневых. Конидиеносцы мало отличаются от гиф. На среде сусло-агар гриб спороношения не дает.

Хорошее спороношение штамм гриба дает при условии культивирования его по способу, предлагаемому в данном техническом решении, т.е. на поверхности металлической пластины из сплава Д16, покрытой присадкой Акор-1, и размещенной на поверхности грибного мицелия на среде сусло-агар в чашках Петри. При этом гриб образует конидии крупные, гладкие, коричневые с поперечными перегородками, которых бывает до 10. Конидиеносцы прямые или извилистые, иногда коленчато-изогнутые, одиночные или в небольших группах, от умеренно до темно-коричневого цвета или оливково-коричневые до 200 мкм длиной, 6-8 мкм шириной. Конидии прямые или слегка согнутые, вытянутые. В состоянии зрелости почти булавовидные, имеют 6-16 псевдосепт (ложных перегородок). Конечные клетки часто светло-окрашенные или очень бледные и отделяются толстыми темными перегородками. Промежуточные клетки золотисто-коричневые, 40-80 мкм длиной и 14-22 мкм в ширину в наиболее широкой части. Светлый кончик четко обозначен.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

Температурный оптимум роста - 30^оС, минимум - 15^оС, максимум - 40^оС. Штамм способен расти на технических консервационных смазочных материалах, на чистых алюминиевых сплавах, вызывать гниль злаковых растений, а также интенсивно вызывать коррозию алюминиевых сплавов, защищенных консервационными смазочными материалами. Штамм растет при диапазоне рН 4-11. На различных консервационных материалах указанный гриб чаще всего развивается с мицелиальными грибами Neurospora sitophila, Tritirachium roseum и бактерии рода Bacillus.

Отношение к источникам азота: хорошо усваивают азотнокислый натрий. Ha DL- α-лейцине, L-аспарагине, DL-аспарагиновой кислоте, DL- α-аланине, L-глутамине, L-глутаминовой кислоте, мочевине, азотнокислом аммонии, сернокислом аммонии растет плохо.

П р и м е р 1. Выращивание гриба Drechslera rostrata (Drechsler) Richardson et Fraser BKMF-3188Д осуществляют на стандартных средах: сусло-агаре и среде Чапека, г/л: NaNO₃ 2; KH₂PO₄ 0,5; MgSO₄˙7H₂O 0,5; KCl 1,-; FeSO₄˙7H₂O 0,01; сахароза 30. Среды стерилизуют, разливают в чашки Петри и затем засевают грибной суспензией. Процесс культирования проводят как в термостате, так и на свету при 20, 35, 30^оС в течение двух недель. После культивирования готовят препараты "раздавленная капля" и микроскопируют в коде зрения биологического микроскопа. В результате микроскопирования спор гриба не обнаруживают. Видны только гифы мицелия.

П р и м е р 2. Выращивание гриба проводят на среде сусло-агар как описано в примере 1. Только на поверхность суточного газона гриба в чашках Петри располагают предметное стекло, покрытое присадкой Акор-1 как описано выше. Культивирование осуществляют при температурах аналогично примеру 1 в течение 9, 14, 21, 30 сут как в термостате, так и при дневном освещении. Результаты микрокопирования также показали отсутствие спороношения у гриба.

П р и м е р 3. Выращивание гриба проводят аналогично примеру 1, только на поверхность суточного газона гриба в чашках Петри со средой сусло-агар располагают стерильные металлические пластины из сплава Д16 размером 20х30 мм с нанесенным на них, как описывалось выше, тонким слоем присадки Акор-1. Чашки также выдерживают при заданных температурах в термостате и на свету 9, 14, 21, 30 сут. В поле зрения микроскопа в препарате "раздавленная капля" выявляются споры гриба на девятые сутки роста при дневном освещении и температуре 25-30^оС.

Таким образом, предлагаемый способ культивировании гриба Drecgslera rostrata (Drechsler) Richardson et Fraser BKMF-3188Д обеспечивает появление спороношения гриба в процессе создания элективных условий, обеспечивающих развитие тропических изолятов грибов рода Drechslera. Такие условия создают путем размещения на питательной среде сусло-агар в чашках Петри металлических пластин из сплава Д16, покрытых антикоррозионной присадкой Акор-1. При этом гриб, выросший на питательной среде сусло-агар в виде мицелия, переходя при росте на присадку Акор-1 с металлической пластиной, на девятые сутки роста начинает образовывать конидиальную стадию на свету, необходимую для его дальнейшего развития и идентификации.

В процессе появления конидиальной стадии гриба и при дальнейшем его росте идет интенсивная коррозия металла, что позволяет использовать этот штамм в качестве тест-культуры при оценке биостойкости консервационных смазочных материалов, наносимых на металлы, применяемые в военной технике в тропических условиях Республики Куба и разработке для них средств защиты от коррозии и биоповреждений. Предлагаемый способ культивирования возможно применять в любой микологической лаборатории, занимающейся разработкой средств защиты металлов от биокоррозии.

Изобретение относится к микробиологии, а точнее к микологии, и касается способа культивирования гриба Drechslera rostrata, позволяющего получить конидиальную стадию микромицета, с целью дальнейшей его идентификации. Способ культивирования гриба основан на применении металлической пластины из сплава Д-16, покрытой консервационным материалом, при росте на котором гриба Drechslera rostrata при периодической освещенности и температуре 25 ± 2^°C появляется конидиальная стадия, являющаяся основой для дальнейшей идентификации.

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА DRECHSLERA ROSTRATA (DRECHSLER)RICHARDSON ET FRASER BKMF-3188 на среде сусло-агар при 25 - 30^oС, отличающийся тем, что, с целью достижения эффекта спороношения гриба, позволяющего его идентифицировать, в среду сусло-агар, инфицированную грибом, помещают металлическую подложку из сплава Д-16, на поверхность которой предварительно наносят тонкий слой противокоррозионной присадки Акор - 1, с последующей выдержкой при дневном освещении в течение 9 - 14 сут.