Изобретение относится к области технической бактериологии и представляет собой новый штамм бактерии, используемый для оценки бактериостойкости сталей, применяемых в тропическом климате, в лабораторных условиях.
Известна группа бактерий Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans, используемых при лабораторных методах испытаний масел и смазок на устойчивость к воздействию бактерий [1]
Недостатком этой группы бактерий является незначительная активность к стальным сплавам, применяемым в условиях тропиков.
Известен штамм бактерии Bacillus subtilis продуцент β- амилазы [2]
Недостатком этого штамма является отсутствие его активности по отношению к металлам. Он используется для производства ферментных препаратов b - амилазы в пищевой промышленности.
В качестве прототипа, наиболее близкого к предлагаемому штамму по назначению, является штамм Bacillus subtitlis ВКМВ-1647Д, используемый в качестве тест-культуры для испытания алюминиевых сплавов на бактериостойкость [3]
Недостатком этого штамма является незначительно высокая его активность по отношению к сталям, экспортируемым в страны с тропическим климатом.
Цель изобретения получение агрессивного изолята бактерий-деструктора сталей, применяемых в условиях тропического климата, безопасного для здоровья людей.
Для получения штамма Bacillus sp. была исследована микрофлора продуктов коррозии сталей как не защищенных, так и защищенных консервационными смазочными материалами, проходившими натурные испытания 16 месяцев в разных климатических зонах Республики Куба. Из различных 180 образцов сталей, прокорродировавших в результате натурных испытаний в тропиках, были выделены разнообразные бактерии. Причем было отмечено, что видовой состав бактерий, обнаруженных в продуктах коррозии металлов, защищенных консервационными смазочными материалами, идентичен видовому составу бактерий, содержащихся в продуктах коррозии металлов, не защищенных смазочными материалами. Наиболее часто на пораженных коррозией стальных сплавах встречались бактерии рода Bacillus. Наиболее жизнеспособным и агрессивным по отношению к различным маркам сталей типа Ст. 3, Ст. 45, ШХ15 оказался предлагаемый штамм Bacillus sp. который депонирован в коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером ВКМВ-1780Д. Новый штамм Bacillus sp. ВКМВ-1780Д выделен из продуктов коррозии сплава Ст. 3, защищенного составом ВК-4, проходившем испытания 16 месяцев на морской станции Республики Куба.
Характеристика штамма
Культуральные признаки. Колонии на агаре Хиттингера слегка желтоватые, плоские, центральная часть приподнята, шероховатые, край неровный. Через 16
18 ч при температуре 37oC штамм образует колонии диаметром 2-3 мм. Рост по штриху перистый. В жидкой питательной среде образует пленку, слабую муть и тонкий осадок. Хорошо растет на средах МПА и БСА (сусло-агар + МПА в соотношении 1:1).
Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, 0,8-0,9 х 3,0-5,0 мкм, подвижные с латеральными жгутиками, грамположительные, образуют термоустойчивые эндоспоры овальной формы с центральным расположением в клетке, спорангий не расширен.
Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду аэроб. Оптимальная температура роста 37oC, пределы роста 10-50oC. Растет на средах с pH от 5,5 до 9,0, оптимум pH 7,0. Азот утилизирует в виде нитратов, мочевины. Дает положительную реакцию на каталазу и оксидазу. Образует ацетилметилкарбинол и индол. Не расщепляет аргинин, тирозин, эскулин. Не дезаминирует фенилаланин. Отсутствует лецитиназная активность. Гидролизует казеин, желатин, крахмал. Расщепляет с образованием кислоты углеводы: глюкозу, маннит, ксилозу, арабинозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, целлобиозу. Не утилизирует лактозу, дульцит, салицин, рамнозу, трегалозу и галактозу. Растет на средах, содержащих 0,001% лизоцима, 0,02% азида натрия, 10% хлорида натрия, а также на среде Сабуро и на синтетической среде М-9. Высокочувствителен к антибиотикам: неомицину, эритромицину. Чувствителен к олеандомицину, ампициллину, канамицину. Малочувствителен к ристомицину, линкомицину, стрептомицину, левомицетину, пенициллину.
При испытании культуры на токсичность и патогенность по методике Госфармакопеи Х штамм не проявляет патогенных или токсигенных свойств.
Хранение штамма. В лиофильно высушенном состоянии в обезжиренном молоке, а также в пробирках с агаром Хоттингера, МПА, БСА, в обводненном масле МК-8 или МС-8РК, в минеральной среде состава, NaNO3 0,2-0,35; MgSO4 0,35-0,6; KH2PO4 0,07-0,15; KCl 0,15-0,25; вода остальное, с вышеуказанными маслами в соотношении масло среда 2:5.
Примеры практического использования предлагаемого штамма.
Пример 1. Выделение штамма. С пораженных коррозией металлических образцов из стального сплава Ст. 3, защищенного составом ВК-4, проходившим натурные испытания 16 месяцев на морской станции тропического климата Республики Куба, соскабливали стерильным шпателем 0,1 г продуктов коррозии бурого цвета, переносили с соблюдением стерильности в ступку, затем измельчали и переносили в чашку Петри с застывшей средой МПА. Помещенные на поверхность питательной среды продукты коррозии стали тщательно растирали стерильным шпателем по всей поверхности среды сначала в первой чашке, а затем этим же шпателем протирали поверхность среды последовательно во 2-й, 3-й, 4-й и 5-й чашках. Чашки закрывали крышками и инкубировали в термостате при температуре 37oC в течение 3-5 суток. По истечении времени инкубирования в первой чашке наблюдался рост смеси бактерий, а в последней преимущественно уже изолированные колонии Bacillus sp. из которых небольшое количество спор перевивочной иглой переносили в чашки Петри с застывшей средой МПА и также инкубировали при температуре 37oC в течение 3-5 суток. Чистую культуру бактерии проверяли на чистоту, переносили в пробирки на скошенную питательную среду МПА, инкубировали, а затем хранили в холодильнике. Полученную чистую культуру бактерии применяли для испытания стальных сплавов на бактериостойкость.
Пример 2. Испытание стальных сплавов на бактериостойкость. Для испытания стальных сплавов на устойчивость к штамму бактерии Bacillus sp. ВКМВ-1780Д вначале подготавливали образцы из Ст. 5, Ст. 45 и ШХ15. При этом нарезали из этих сплавов образцы размером 10 х 20 х 2 мм, шлифовали до класса ▿0,4 чистоты поверхности. Затем образцы обезжиривали бензином Б-70, протирая мягкой ветошью, смоченной в бензине, по поверхности металлической пластины. Аналогичным образом проводили обезжиривание в ацетоне. После обезжиривания образцы взвешивали на весах Sartoius, заворачивали в крафт-бумагу и стерилизовали 2 ч в сушильном шкафу HS61A при температуре 165oC. Подготовленные таким образом образцы стальных сплавов подвергали исследованию на бактериостойкость контактным методом, сущность которого заключается в выдерживании образцов из стальных сплавов на поверхности газона Bacillus sp. выросшего на питательной среде БСА (сусло-агар + МПА в соотношении 1:1) в чашках Петри.
На поверхность питательной среды БСА в чашках Петри помещали одну бактериологическую петлю спор бактерии и растирали равномерно шпателем по всей поверхности питательной среды. Затем чашки Петри ставили в термостат при температуре 37oС. После термостатирования, когда на поверхности среды наблюдался сплошной рост бактериальной культуры, на его поверхность стерильным пинцетом размещали простерилизованные образцы из предварительно подготовленных к испытаниям сплавов Ст. 3, Ст. 45 и ШХ15. Количество испытанных образцов каждого сплава равнялось 5 шт. Контролем служили такие же образцы металлов, но помещенные на поверхность стерильной питательной среды БСА, не засеянной тест-культурой.
Подготовленные к испытаниям чашки Петри с металлическими образцами помещали в эксикатор, на дно которого наливали стерильную дистиллированную воду, за счет чего в эксикаторе поддерживали влажность 96-98% Эксикаторы располагали в термостатной комнате при температуре 40oC. Продолжительность экспозиции опытных и контрольных образцов 6 месяцев.
Аналогичные испытания проводили со штаммом Bacillus subtilis ВКМВ-1647, который использовали в качестве прототипа.
После окончания испытаний чашки Петри с металлическими образцами подвергали стерилизации 2 ч в автоклаве ВК-75 при давлении 2 атм и температуре 120o. Затем образцы из стальных сплавов очищали от мицелия, питательной среды и продуктов коррозии с помощью скальпеля. Окончательно продукты коррозии стальных сплавов удаляли в растворе состава:
Кислота соляная (пл. 1,19) 500 см3/дм3
Ингибитор ПБ-5 10 г/дм3
Температура 18 25oC
При удалении продуктов коррозии образцы пинцетом в вертикальном положении опускали в раствор, налитый в стакан, и выдерживали 10 мин. Далее образцы вынимали из раствора, промывали сначала в воде, затем в ацетоне, просушивали и взвешивали.
Потерю массы образцов определяли по формуле
где Δm потеря массы испытуемого образца, г, равная
Δm = mo-m,
где mо масса образца до испытаний, г;
m масса образца после испытаний и удаления продуктов коррозии, г.
Площадь коррозионных поражений определяли наложением на оцениваемую поверхность металлического образца пластины из прозрачного материала с нанесенной на нее сеткой. По результатам измерения площади коррозионных очагов (количество клеток на пластине) вычисляли процент коррозионного поражения образцов из стальных сплавов по формуле
где S1 площадь коррозионного очага на лицевой стороне образца, клетки;
S2 площадь коррозионного очага на оборотной стороне образца, клетки;
Sоцен площадь оцениваемой поверхности всего образца, клетки.
Глубину коррозионных поражений стальных сплавов замеряли с помощью глубиномера-индикатора часового типа со съемной иглой с ценой деления 1/100 мм. Незначительную глубину язв измеряли с помощью профилометра-профилографа Талисерф-10.
Результаты сравнительных испытаний на бактериостойкость образцов из стальных сплавов с использованием в качестве тест-культур штаммов бактерий Bacillus sp. ВКМВ-1780Д и Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д представлены в табл. 1-3.
Из представленных в табл. 1 результатов исследований видно, что бактериостойкость сплавов Ст. 3, Ст. 45 и ШХ15 обратно пропорциональна площади пораженной поверхности образцов. Испытания показали, что при использовании в качестве тест-культуры предлагаемого штамма бактерии площадь пораженной поверхности образцов за тот же промежуток времени для всех стальных сплавов возросла в 2 раза после 6 месяцев испытаний по сравнению с прототипом.
При визуальном осмотре во времени было обнаружено, что первые очаги коррозии на стальных сплавах Ст. 3 и Ст. 45 появились на 20 суток, а на сплаве ШХ15 на 15 суток раньше при непосредственном их контакте с предлагаемым штаммом бактерии, чем при непосредственном контакте с бактериальным штаммом, используемым в качестве прототипа.
Из табл. 2 следует, что убыль массы металла из стальных сплавов Ст. 3, Ст. 45 и ШХ15 под действием предлагаемого штамма бактерии в 2 раза превышает убыль массы под действием штамма бактерии, используемого в качестве прототипа. Это свидетельствует о более высокой коррозионной активности штамма Bacillus sp. ВКМВ-1780 по сравнению со штаммом Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д.
Из табл. 3 видно, что глубина коррозионных поражений стальных сплавов под действием предлагаемого штамма в 2 раза и более превышает глубину коррозионных поражений образцов по сравнению с известным штаммом-прототипом.
Из представленных результатов экспериментальных исследований видно, что использование предлагаемого штамма бактерии в качестве тест-культуры позволяет повысить достоверность результатов при испытании стальных сплавов, применяемых в условиях тропиков, на бактериостойкость.
Следовательно, штамм Bacillus sp. BKMB-1780Д может быть применен организациями, создающими стальные сплавы, стойкие к воздействию тропических штаммов бактерий, с целью применения этих сплавов в странах с тропическим климатом.
С помощью этого штамма можно проверять стойкость других стальных сплавов к воздействию бактерий при необходимости поставки изделий из стальных сплавов в страны с тропическим климатом.
Использование: биотехнология, техническая бактериология. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Bacillus species ВКМВ-1780Д, используемый в качестве тест-культуры для определения бактериологической стойкости стальных сплавов, применяемых в тропическом климате. Предлагаемый штамм является более агрессивным и способен деструктировать большее количество сплавов, чем известный штамм того же назначения. При применении предлагаемого штамма повышается достоверность результатов во время испытаний стальных сплавов, используемых в условиях тропиков. Изобретение может представлять интерес при создании стальных сплавов, стойких к воздействию тропических штаммов бактерий. 3 табл.
Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМВ-1780 Д, используемый в качестве тест-культуры для определения биологической стойкости стальных сплавов.
