Изобретение относится к области технической бактериологии и представляет собой новый штамм бактерий, используемый для оценки бактериостойкости алюминиевых и магниевых сплавов, применяемых в тропическим климате, в лабораторных условиях.
Известна группа бактерий Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans, используемых при лабораторных методах испытаний масел и смазок к воздействию бактерий [1]
Недостатком этой группы бактерий является незначительная активность к алюминиевым и магниевым сплавам, применяемым в условиях тропиков.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент β -амилазы [2]
Недостатком этого штамма является отсутствие его активности по отношению к металлическим сплавам. Он используется для производства ферментных препаратов b амилазы в пищевой промышленности.
Наиболее близким по значению к предлагаемому штамму является штамм Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д, используемый в качестве тест-культуры для испытания алюминиевых сплавов типа Д16Т на бактериостойкость [3]
Недостаток этого штамма невысокая активность по отношению к алюминиевым сплавам типа Д16Т и отсутствие деструктирующих свойств по отношению к другому алюминиевому сплаву типа АК6 и магниевому сплаву типа МА8, предназначенным для использования в странах с тропическим климатом.
Задача изобретения получение агрессивного штамма изолята бактерии - деструктора алюминиевых и магниевых сплавов, применяемых в условиях тропиков.
Для получения штамма Bacillus sp. была использована микрофлора продуктов коррозии металлических образцов из алюминиевых сплавов как не защищенных, так и защищенных консервационными смазочными материалами, проходившими натурные испытания в течение 16 месяцев в тропическом климате Республики Куба.
Из различных образцов алюминиевых сплавов, прокорродировавших в результате натурных испытаний в тропическом климате, были выделены различные бактерии. Наиболее часто в продуктах коррозии алюминиевых сплавов различных марок встречался штамм Bacillus sp. Из 225 образцов алюминиевых сплавов указанный штамм был обнаружен в продуктах коррозии 185 образцов, преимущественно проходивших испытания на сельской станции Республики Куба. Наиболее жизнеспособным и агрессивным по отношению к сплавам типа АК6, Д16Т и магниевому сплаву МА8 оказался предлагаемый штамм Bacillus sp. Этот штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером ВКМВ-1790Д.
Культурально-морфологические особенности штамма
Штамм бактерий через 48 ч роста при 32oC на агаре Хоттингера образует колонии диаметром 1-3 мм серовато-желтого цвета, плоские, с неровным краем, матовым блеском. На жидких питательных средах образует слабую муть и придонный осадок. Штамм хорошо растет на среде МПА и на среде БСА (сусло-агар и МПБ в соотношении 1:1).
Клетки грамположительные, палочковидные, прямые 0,6-0,7 х 2,0-4,0 мкм, подвижные. Образуют устойчивые эндоспоры. Споры овальные, доминирующие, расположение в клетке центральное, спорангий не расширен.
Физико-биохимические признаки
Рост штамма в пределах температур 45 20oC, оптимум 32oC. Границы pH для роста 6,0 -11,0, оптимум 8,0. Аэроб. Пределы параметров роста установлены на агаре (1,5%) Хоттингера.
Штамм образует каталазу, оксидазу, ацетоген не образует. Расщепляет с образованием кислоты углероды: глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит, сахарозу, салицин. Не ферментирует лактозу, дульцит, рамнозу, мальтозу, галактозу. Восстанавливает нитраты. Мочевину не разлагает. Не гидролизует крахмал, желатин, казеин, тирозин, эксулин. Не имеет лецитиназы, аргининдегидролазы. Не дезаминирует фенилаланин.
Растет на средах, содержащих 10% хлорида натрия, 0,02 азида натрия. Не растет на среде Сабуро и на среде с лизоцимом (0,001). Не чувствителен к антибиотикам. Непатогенен. Хранить штамм можно в лиофильно высушенном состоянии в стерильных ампулах.
Пример 1. Выделение штамма. С пораженных коррозией металлических образцов из алюминиевого сплава АМц-8, защищенного консервационным составом НГ-203Б, проходившим натурные испытания 16 месяцев на сельской станции в тропическом климате Республика Куба, соскабливают стерильным шпателем 0,1 г рыхлых гелеобразных продуктов коррозий сплава, переносят с соблюдением стерильности в ступку, затем измельчают и переносят в чашку Петри с застывшей средой МПА. Помещенные на поверхность питательной среды продукты коррозии алюминиевого сплава тщательно растирают стерильным шпателем по всей поверхности среды сначала в первой чаше, а затем этим же шпателем протирают поверхность среды последовательно во 2-й, 3-й, 4-й и 5-й чашках. Чашки закрывают крышками и инкубируют в термостате при температуре 32oC в течение 3 5 суток. По истечении времени инкубирования в первой чашке наблюдается рост смеси различных бактерий, а в последней преимущественно уже изолированные колонии Bacillus sp. из которых небольшое количество спор перевивочной иглой переносят в чашки Петри с застывшей средой МПА и также инкубируют при температуре 32oC в течение 3 5 суток. Чистую культуру бактерии проверяют на чистоту, переносят в пробирки на скошенную питательную среду МПА, инкубируют, а затем хранят в холодильнике. Полученную чистую культуру бактерий применяют для испытания алюминиевых и магниевых сплавов на бактериостойкость.
Пример 2. Испытание алюминиевых и магниевых сплавов на бактериостойкость. Для испытания сплава АК6 на бактериостойкость нарезают из прутка алюминиевого сплава АК6 образцы диаметром 50 мм и толщиной 4 мм, затем по диаметру каждый образец разрезают на четыре равные секторные части.
При подготовке образцов из алюминиевого сплава типа Д16Т металлические образцы нарезают из плоского плакированного листа алюминиевого сплава Д16Т размером 10х50х2 мм.
При подготовке образцов из магниевого сплава нарезают из плоского прокатного листа магниевого сплава МА8 с оксидированной поверхностью пластины размером 10х50х2 мм, у которых плоские стороны имеют оксидное защитное покрытие заводской поставки, а торцы не имеют защитного покрытия.
Торцы всех подготовленных образцов зачищают от заусенцев наждачной бумагой.
Подготовленные таким образом металлические образцы обезжиривают венской известью с помощью щеточки, промывают водопроводной водой, промокают фильтровальной бумагой и высушивают в сушильном шкафу при 80oC в течение 15 мин. Высушенные образцы взвешивают на весах Sartorius, заворачивают в крафт-бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу HS61A при температуре 165oC в течение 2 ч. Охлажденные простерилизованные образцы металлов подвергают испытаниям на бактериостойкость по отношению к выделенному по примеру 1 штамму Bacillus sp. ВКМВ-1790Д.
Исследование сплавов АК6, Д16Т, МА8 на бактериостойкость осуществляют контактным методом, сущность которого заключается в выдерживании образцов из алюминиевых и магниевых сплавов на поверхности газона Bacillus sp. выросшего на питательной среде БСА (сусло-агар + МПА в соотношении 1:1) в чашках Петри.
На поверхность питательной среды БСА в чашках Петри помещают одну бактериологическую петлю спор Bacillus sp. и растирают равномерно шпателем по всей поверхности питательной среды. Затем чашки Петри ставят в термостат при температуре 32oC. После термостатирования, когда на поверхности среды наблюдается сплошной рост бактериальной культуры, на поверхность сплава стерильным пинцетом размещают простерилизованные образцы из предварительно подготовленных к испытаниям сплавов АК6, Д16Т, МА8. Количество испытанных образцов каждого сплава равняется пяти. Контролем служат такие же образцы металлов, но помещенные на поверхность стерильной питательной среды БСА, не засеянной тест-культурой.
Подготовленные к испытаниям чашки Петри с металлическими образцами помещают в эксикатор, на дно которого наливают стерильную дистиллированную воду, за счет чего в эксикаторе поддерживают влажность 96-98% Эксикаторы располагают в термостатной комнате при температуре 35oC. Продолжительность экспозиции опытных и контрольных образцов 6 месяцев.
Аналогичные испытания проводят со штаммом Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д, который используют в качестве прототипа.
После окончания испытаний чашки Петри с металлическими образцами подвергают стерилизации в автоклаве ВК-75 при давлении 2 атм и температуре 120oC в течение 2 ч. После стерилизации образцы из алюминиевых и магниевых сплавов очищают от мицелия, питательной среды и продуктов коррозии с помощью скальпеля.
Окончательно продукты коррозии алюминиевых сплавов удаляют в растворе состава:
Окись хрома (VI) 200 г/дм3
Кислота ортофосфорная (пл. 1,59 г/см3) 50 cм3/дм3
Температура 85oC
Продукты коррозии магниевого сплава удаляют в растворе состава:
Ангидрид хромовый 200 г/дм3
Температура 25oC
При удалении продуктов коррозии алюминиевых и магниевых сплавов металлические образцы в вертикальном положении опускают в соответствующие растворы, налитые в стаканы, и выдерживают, мин:
Для алюминиевых сплавов 5
Для магниевых сплавов 3
После удаления продуктов коррозии образцы металлов промывают в проточной, а затем дистиллированной воде, просушивают в сушильном шкафу при температуре 100±2oC в течение 5 мин, выдерживают над осушителем в течение 24 ч в эксикаторе и взвешивают.
Потерю массы образцов определяют по формуле:
где Δm потеря массы испытуемого образца, г, равная
Δm = mo-m,
здесь m0 масса образца до испытаний, г;
m масса образца после испытаний и удаления продуктов коррозии, г.
Площадь коррозионных поражений определяют наложением на оцениваемую поверхность металлического образца пластины из прозрачного материала с нанесенной на ней сеткой. По результатам измерения площади коррозионных очагов (количество клеток на пластине) вычисляют процент коррозионного поражения образцов из алюминиевых и магниевых сплавов по формуле
,
где S1 площадь коррозионного очага на лицевой стороне образца, клетки;
S2 площадь коррозионного очага на оборотной стороне образца, клетки;
Sоцен площадь оцениваемой поверхности всего образца, клетки.
Глубину коррозионных поражений алюминиевых и магниевых сплавов замеряют с помощью глубиномера-индикатора часового типа со съемной иглой с ценой деления 1/100 мм. Незначительную глубину язв измеряют с помощью профилометра-профилографа Талисерф-10.
Результаты сравнительных испытаний на бактериостойкость образцов из алюминиевых и магниевых сплавов с использованием в качестве тест-культур штаммов бактерий Bacillus sp. ВКМВ-1790Д и Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д представлены в табл. 1-3.
Из представленных в табл. 1 результатов исследований видно, что бактериостойкость сплавов АК6, Д16Т и МА8 обратно пропорциональна площади пораженной поверхности образцов. Испытания показывают, что при использовании в качестве тест-культуры предлагаемого штамма бактерий площадь пораженной поверхности образцов за тот же промежуток времени для алюминиевого сплава АК 6 возрастает в 2 раза, для сплава Д16Т на 19% и для магниевого сплава МА8 на 19% после 6 месяцев испытаний по сравнению с известным штаммом. При визуальном осмотре во времени обнаружено, что первые очаги коррозии на алюминиевых сплавах появляются на 10-12 суток, а на магниевом сплаве на 7 суток раньше при непосредственном их контакте с предлагаемым штаммом бактерий, чем при непосредственном контакте с известным бактериальным штаммом.
Из данных табл. 2 следует, что убыль массы металла из алюминиевых сплавов АК6, Д16Т и магниевого сплава МА8 под действием предлагаемого штамма бактерий в 2 раза превышает убыль массы под действием известного штамма. Это свидетельствует о более высокой коррозионной активности штамма Bacillus sp. ВКМВ-1790Д по сравнению со штаммом Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д.
Из данных табл. 3 видно, что глубина коррозионных поражений алюминиевых сплавов под действием предлагаемого штамма в 2 раза превышает глубину коррозионных поражений образцов, а для магниевого сплава даже в 4 раза по сравнению с известным штаммом.
Следовательно, использование предлагаемого штамма бактерии в качестве тест-культуры позволяет повысить достоверность результатов при испытании алюминиевых и магниевых сплавов, применяемых в условиях тропиков, на бактериостойкость.
Использование: биотехнология, техническая бактериология. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Bacillus species ВКМВ-1790Д, используемый в качестве тест-культуры для испытания алюминиевых и магниевых сплавов, применяемых в тропическом климате. Предлагаемый штамм более агрессивен и способен деструктировать большее количество сплавов (АК6, Д16Т, МА8) по сравнению с известным штаммом того же назначения. В результате использование предлагаемого штамма позволяет повысить достоверность результатов при испытании алюминиевых и магниевых сплавов на бактериостойкость в условиях тропиков. Изобретение может представлять интерес при создании указанных сплавов, стойких к воздействию тропических штаммов бактерий и направляемых для применения в страны тропического климата. 3 табл.
Штамм бактерий Bacillus species ВКМВ-1790 Д, используемый в качестве тест-культуры для определения бактериологической стойкости алюминиевых и магниевых сплавов.
