ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA TROPICALIS - ПРОДУЦЕНТ БИОМАССЫ, ОБОГАЩЕННОЙ БЕЛКОМ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/16 C12N1/16 C12R1/74 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей, который может быть использован для получения кормовых дрожжей на основе н-парафинов.

Известно, что в основе процессов микробиологического синтеза лежит использование в технологии штаммов-продуцентов, промышленно ценные свойства которых обусловливают производительность и качество готового продукта, а их биологические свойства (непатогенность) - экологическую безопасность производства.

Известно большое число штаммов дрожжей, которые могут быть использованы в микробиологической промышленности. Это штаммы Candida maltosa ВСБ-569, ВСБ-640, ВСБ-638, ВСБ-777, ВСБ-744, ВСБ-779. Недостатком известных штаммов дрожжей является их мезофильность, т.е. способность активного роста только в узком интервале температур 32-34^оС.

Описаны термотолерантные штаммы дрожжей Candida tropicalis К-41, Н-33, Н-436а, ВСБ-928, штамм С.rugosa ВСБ-925; штамм С.parapsilosis ВСБ-906; штамм С. quilliermondii ВСБ-774; С.parapsilosis ВСБ-908; штамм С.tropicalis ВСБ-936; ВСБ-935.

Недостаток перечисленных штаммов дрожжей состоит в том, что они способны расти при повышенной температуре 38-39^оС (некоторые даже при 41,5^оС) или в широком интервале температур 28-39^оС, но при температуре выращивания 38-39^оС значительно, на 15-20%, снижают выход биомассы.

Наиболее близким к заявляемому штамму является термотолерантный штамм дрожжей С.tropicalis ВСБ-928 К, ВКПМ У-1322 - продуцент белковой биомассы, характеризующийся способностью роста при температуре 30-41^оС, рН среды 3,5-5,5 на н-парафинах различного фракционного состава с сохранением свойств по продуктивности и содержанию сырого протеина в биомассе на уровне мезофильных штаммов.

Штамм (ВСБ-928 К) был получен в процессе промышленной селекции на Кстовском ОПЗ БВК при производстве паприна в период работы завода при температуре 37-41^оС. Известный штамм имеет следующие характеристики в условиях камеральных испытаний: допустимый интервал температурного режима процесса культивирования 32-39^оС; выход биомассы от заданного источника углерода при температуре 32-38^оС составляет 91-92,7%; удельная скорость роста 0,275 ч^-1; при температуре роста 39-40^оС соответственно 71,8% и 0,22 ч^-1. При испытаниях и внедрении в промышленных условиях при температуре 37-40^оС выход биомассы 95-100% , производительность в среднем 3,3 кг/м³/ч при содержании сырого протеина 60-62%. Штамм устойчив к продуктам метаболизма и выдерживает уровень ХПК культуральной жидкости в пределах 3-3,5 тыс. мг О₂/л.

Недостаток штамма-прототипа состоит в том, что при температуре роста 32-34^оС он имеет недостаточно высокий выход биомассы 92,7% и меньшую удельную скорость роста 0,28 ч^-1 по сравнению с мезофильным штаммом, например, С.maltosa ВСБ-899 (ЦМПМУ-262), имеющий следующие показатели: 96,2% и 0,33 ч^-1 соответственно. Это приводит к тому, что штамм ВСБ-928 К при данной температуре менее конкурентоспособен по сравнению с мезофильным штаммом, что может приводить к вытеснению штамма ВСБ-928 К, поэтому штамм-прототип рекомендован к промышленному внедрению в качестве компонента смешанной культуры.

Другим недостатком штамма-прототипа ВСБ-928 К является несколько сниженные промышленно-ценные показатели - продуктивность и скорость роста - при температуре роста 39-40^оС, а именно эти показатели культуры определяют стабильность производительности, конкурентоспособность штамма в нестерильных условиях культивирования и его доминирование в биоценозе ферментеров.

К числу недостатков штамма-прототипа следует отнести отсутствие характеристик по способности роста на н-парафинах с повышенным содержанием в них ароматических углеводородов, практически постоянно применяемы в качестве субстрата на производствах.

В связи с изложенным задача изобретения заключалась в селекции нового конкурентоспособного непатогенного термотолерантного штамма дрожжей, характеризующегося высокой продуктивностью и удельной скоростью роста при температуре 32-34^оС, не уступая мезофильному штамму, максимально сохраняющему эти свойства при температуре 37-40^оС, что обеспечит ему конкурентоспособность с другими термотолерантными штаммами (например, штаммом-прототипом ВСБ-928 К), а также способностью роста на н-парафинах с содержанием ароматических углеводородов на уровне 0,01%-0,8%.

Предлагаемый штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-942 получен в процессе промышленной селекции в условиях Мозырского завода кормовых дрожжей при непрерывном процессе культивирования при температуре 32-39^оС на н-парафинах с содержанием ароматических углеводородов 0,01-0,8%, с использованием в период работы штамма-продуцента С.maltosa ВСБ-899 с наличием в биоценозе ферментеров "диких" дрожжей Сandida tropicalis.

Для осуществления исследований по промышленной селекции из биоценоза ферментеров было выделено 88 дрожжевых изолятов на селективную среду сусло-агар с трифенилтетразолийхлоридом, которая по окраске колоний малинового цвета позволяла отобрать дрожжи, относящиеся к С.tropicalis; колонии дрожжей C.maltosa на данной среде имели бесцветную (слабо кремовую) окраску.

Первичную физиологическую активность роста выделенных изолятов дрожжей осуществляли в модельных опытах в колбах на качалке на минеральной среде с 0,1% автолизата и без него и с н-парафином при температуре 32-34^оС. В табл. 1 представлены данные для 5-ти наиболее активных изолятов, обозначенных шифрами М-2, М-3, М-27, М-32, М-33, в сравнении со штаммом-прототипом ВСБ-928К и мезофильным штаммом-контролем ВСБ-899. Согласно полученным данным, изолят дрожжей М-2 характеризовался наибольшим накоплением биомассы на среде с автолизатом: 9,0-10,5 ед. опт. пл. , т.е. практически на уровне контроля и прототипа.

Испытание 5-ти изолятов дрожжей по признаку термотолерантности и стабильности данного признака, т.е. способности сохранять свойство термотолерантности в условиях длительного многократного пассирования, проводили также в модельных опытах в качалочных колбах на минеральной среде с 0,1% автолизата при температуре 37-38^оС.

Согласно данным табл. 2 наибольшую активность роста и стабильность признака термотолерантности имели 2 изолята дрожжей: М-2 и М-3. Мезофильный штамм ВСБ-899 в этих же условиях имел более низкие показатели по сравнению с термотолерантным штаммом ВСБ-928К и выделенными промышленными изолятами.

Штамм ВСБ-928К имел довольно высокий показатель накопления биомассы как в первом, так и при последующих 4-х пассажах.

Изоляты дрожжей М-2 и М-3 были идентифицированы по систематическому положению и отнесены к Candida tropicalis в соответствии с общепринятым определителем Крегер-ван-Рай (The Jeast taxonomyc study. Kreger-van-Ruy. N. Y.W. 1984).

Изучение биологических свойств, проведенное Ангарским институтом гигиены труда и профзаболеваний, показало, что изоляты М-2 и М-3 являются непатогенными, что позволило проводить дальнейшие исследования в камеральных условиях.

Активность роста промышленных термотолерантных изолятов дрожжей М-2 и М-3 была проведена в периодической культуре в аппарате интенсивного массообмена (фирмы "Мирубиши") при температуре роста 37-41^оС. При этом был подтвержден признак термотолерантности этих изолятов, но показатели накопления биомассы у изолята М-2 были более близкими к штамму ВСБ-928К (табл. 3). Мезофильный штамм ВСБ-899-контроль резко снижал активность роста при температуре роста 38-39^оС; при температуре 40-41^оС - роста дрожжей отсутствовал.

Изучение кинетических и физиологических характеристик отобранного изолята М-2 было проведено в периодической культуре в камеральных условиях экспериментального стенда института в аппарате интенсивного массообмена в сравнении со штаммом-прототипом ВСБ-928К и мезофильным штаммом ВСБ-899.

Согласно полученным данным изолят М-2 при температуре роста 32-34^оС имел показатели, сходные с мезофильным штаммом ВСБ-899: выход биомассы 105,1% удельная скорость роста 0,33 ч^-1. При температуре роста 37-40,5^оС выход биомассы и удельная скорость роста были близки к штамму-прототипу ВСБ-928К (табл.4). При этом качество готового продукта по содержанию сырого протеина при температуре роста 32-34^оС у изолята М-2 было на уровне мезофильного штамма ВСБ-899, а при температуре 37-40,5^оС - на уровне штамма-прототипа ВСБ-928К (табл.5).

Специальные исследования были проведены по изучению способности роста изолята М-2 на н-парафинах с содержанием ароматических углеводородов 0,03-0,8%.

Согласно полученным данным, активность роста испытанных штаммов при температуре роста 34^оС на н-парафинах с 0,8% ароматических углеводородов составил, г/л: у штамма ВСБ-928К (прототип) 4,1-4,8; ВСБ-899 (контроль) 5,9-6,3; ВСБ-942 (опыт) 5,7-6,4; при температуре роста 37-38^оС - 5,0-6,2; 4,0-4,7 и 5,5-6,4 соответственно.

На основании положительных результатов проведенных исследований и выявления промышленно-ценных физиологических и биологических свойств изолят дрожжей М-2 был принят в музейную коллекцию института в качестве штамма Candida tropicalis ВСБ-942.

Паспортные характеристики термотолерантного штамма Candida tropicalis ВСБ-942.

Морфологические признаки: клетки 3-суточной культуры на глюкозопептонной среде округлые, короткоовальные, овальные; одиночные или короткими цепочками и небольшими веточками. Размер клеток 3,0-6,5 х 3,0-4,5 мк. На картофельном агаре образует хорошо развитый разветвленный псевдомицелий; бластоспоры овальные, короткоовальные.

Культуральные признаки: колонии на сусло-агаре гладкие, с возвышающимся центром, окружены мицелиальной зоной или без нее. Штрих на сусло-агаре гладкий, волнистый с зоной мицелия.

Физиологические признаки:
- ассимилирует: глюкозу, галактозу, сорбозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, мелицитозу, растворимый крахмал, ксилозу, этанол, адонит (рибит), маннит, сорбит (глуцитол), α-метил-Д-глюкозид, салицин, молочную и янтарную кислоты;
- сбраживает: глюкозу, мальтозу, галактозу, сахарозу, трегазозу (слабо).

Цитоморфологическая характеристика: цитоплазма клеток на глюкозопептонной среде и солодовом сусле гомогенная без вакуолей с мелким липидным включением, почкование полярное; на синтетической среде с н-парафином в непрерывной культуре клетки овальные с полярным почкованием (25-45%) с гомогенной цитоплазмой без вакуолей либо вакуоля мелкая, с мелкими липидными включениями либо без них.

Маркером культуры Candida tropicalis ВСБ-942, отличающим ее от дрожжей С. maltosa, используемых на производствах БВК в качестве культуры-продуцента, служит биохимический тест: ассимиляция крахмала, а также малиновый цвет колоний при высеве культуры на сусло-агаре с трифенилтетразолийхлоридом (С. maltosa - крахмал не ассимилирует; на среде сусло-агар с трифенилтетразолием имеет колонии светло-кремового цвета.

Штамм сохраняют в лиофилизированном состоянии или на сусло-агаре под слоем вазелинового масла при комнатной температуре. Периодичность пересевов в последнем случае 3-4 раза в год. Рабочая культура штамма поддерживается путем посева в пробирках (косяках) на сусло-агаре, культивируемых при температуре 32-34^оС в течение 2 сут с последующим хранением при комнатной температуре.

Штамм дрожжей С.tropicalis ВСБ-942 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ у-1987.

Биохимический состав дрожжевой биомассы: содержание сырого протеина 60-64% , содержание белка по Барнштейну 55-59%, липидов 8-11%, золы 6-7%, нуклеиновых кислот 7-9%, влаги 7-8%. Сумма насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе липидов 35,1 и 55,7%. Аминокислотный состав истинного белка представлен, % к АСВ: триптофан 1,0; гистидин 1,9; аргинин 2,2; аспарагиновая кислота 6,6; треонин 3,6; серин 2,6; глютаминовая кислота 8,0; пролин 1,8; глицин 3,3; аланин 3,3; валин 3,6; изолейцин 3,8; лейцин 5,4; тирозин 2,5; фенилаланин 3,4; серусодержащие незаменимые аминокислоты: лизин 5,5; цистин 0,5; метионин 0,8.

Предлагаемый штамм ВСБ-942 был испытан в промышленных условиях Мозырского завода КД в аппаратах отделения чистой культуры: ферментере объемом 40 л; 3,2 м³ и 50 м³ в сравнении со штаммом ВСБ-899, используемым на заводе в качестве культуры-продуцента, и были получены положительные результаты. Так штамм ВСБ-899 при температуре 32-34^оС имел регламентные показатели (табл.6) и такие же показатели имел штамм дрожжей ВСБ-942, но как при температуре 32-34^оС, так и при температуре 37-39^оС. Доминирование штаммов составляло 100%.

Штамм дрожжей ВСБ-942 был испытан в промышленных условиях Мозырского завода КД в непрерывном процессе культивирования при 70%-ном возврате отработанной культуральной жидкости (в аппарате объемом 500 м³) в сравнении с мезофильным штаммом ВСБ-899. Производительность штамма ВСБ-899 при температуре 32-34^оС составила в среднем 28,5 т/сут при удельном съеме с ферментера 2,4 кг/м³/ч; штамм ВСБ-942 при температуре 32-39^оС имел показатели соответственно - 33-36 т/сут и 2,8-3,2 кг/м³/ч. При этом доминирование штамма ВСБ-942 составило 100%, что указывает на его устойчивость к контаминации.

П р и м е р 1. Штамм ВСБ-942 выращивали в периодической культуре в лабораторном ферментере (фирмы "Мирубиши") объемом 5 л и интенсивного массообмена при температуре 32-34^оС, рН среды 4,0-4,2 (автоматическое поддержание 6% -ным раствором аммиака) на минеральной среде следующего состава, г/л: Ортофосфорная кислота (70% ) 2,5 Калий хлористый 1,14 Аммоний сернокислый 1,2 Магний сернокислый 0,55 Железо сернокислое 0,046 Цинк сернокислый 0,033 Марганец сернокислый 0,02
Источником углерода в количестве 2 об.% служили н-парафины следующего состава: С₈-С₁₃ - 33,98%; С₁₄-С₁₈ - 64,70%; С₁₉-С₂₁ - 0,67% ( Σ н-алканов 99,37%), ароматические углеводороды 0,01%.

Выход биомассы от заданного парафина составил 103,3%, удельная скорость роста 0,33 ч^-1; содержание сырого протеина 60,1%.

Для штамма-прототипа ВСБ-928К в тех же условиях культивирования имели место следующие показатели: выход биомассы 94,0%, удельная скорость роста 0,28 ч^-1, содержание сырого протеина 59,8%.

П р и м е р 2. Штамм ВСБ-942 выращивали в режиме по примеру 1 при температуре 37-38^оС.

Выход биомассы составил 93,0%, удельная скорость роста 0,22 ч-1, содержание сырого протеина в биомассе 58,8%; у штамма-прототипа ВСБ-928К - 92,8%, 0,24 ч^-1, 58,9% соответственно.

П р и м е р 3. Штамм ВСБ-942 выращивали в периодическом режиме в колбах (v 800 мл) на качалке на минеральной среде (объемом 100 мл) с 1 об.% н-парафинов с 0,8% ароматических углеводородов при температуре роста 34^оС. Состав среды, г/л: NH₄H₂PO₄ 10; К₂НРО₄ 10; MgSO₄ ˙7H₂O 0,7; ZnSO₄ ˙7H₂O 12,5 мг/л; FeSO₄ ˙7H₂O 12,5 мг/л, MnSO₄ ˙7H₂O 12,5 мг/л; автолизат - 1 мл/л, вода водопроводная до 1 л.

Накопление биомассы составило 6,4 г/л. Штамм-прототип ВСБ 928К имел 4,8 г/л, контрольный штамм ВСБ-899 - 6,3 г/л.

П р и м е р 4. Штамм ВСБ-942 выращивали в непрерывном режиме в промышленном ферментере (рабочий объем 536 м³) интенсивного массообмена (содержание растворенного кислорода в среде 10-15% от насыщения), температура процесса культивирования 33± 1^оС на н-парафинах "Парекс" следующего состава, %: н-алканы 99,46; С₁₃ 46,02; С₁₄-С₁₉ 53,28; С₂₀ 0,16, при возврате отработанной культуральной жидкости 49% и БОВ 11%, скорости потока 83 м³/ч (скорость роста 0,15 ч^-1). Получены следующие показатели: выработка готового продукта 37,7 т/сут, удельный съем АСМ 2,87 кг/м³/ч, содержание сырого протеина 4,3%, белка по Барнштейну 59,2%, липидов 10,3%, золы 7,2%.

Штамм-продуцент ВСБ-899 имел следующие показатели: выработка 32,7 т/сут, удельный съем ВСМ 2,54 кг/м³/ч, содержание сырого протеина 61,8%, белка по Барнштейну 57,6%, липидов 11,2%, золы 7,9%.

П р и м е р 5. Штамм ВСБ-942 выращивали по примеру 3 при температуре 37± 1^оС. Получены следующие показатели: выработка готового продукта 35,3 т/сут, удельный съем АСМ 2,74 кг/м³/ч, содержание сырого протеина 62,4%, белка по Барнштейну 57,5%, липидов 11,6%, золы 7,1%.

Штамм-продуцент ВСБ-899 имел следующие показатели: выработка 26,7 т/сут, удельный съем ВСМ 2,15 кг/м³/ч, содержание сырого протеина 60,7%, белка по Барнштейну 55,6%, липидов 11,3%, золы 7,0%.

П р и м е р 6. Штамм ВСБ-942 выращивали в непрерывном процессе культивирования по примеру 3 на н-парафинах с повышенным содержанием ароматических углеводородов. Состав н-парафина Ново-Куйбышевского ЕПЗ: н-алканы 97,04% (С₁₃ 10,14%; С₁₄-С₁₉ 21,7%; С₂₀ и более 65,2), ароматические углеводороды 0,3%. Получены следующие показатели: выработка дрожжевой биомассы 32,6 т/сут; выход от парафина 84,6%; удельный съем АСД - 2,66 кг/м³/ч; удельная скорость роста 0,18 ч^-1.

Штамм-продуцент ВСБ-899 имел следующие показатели: выработка биомассы 27,8 т/сут; удельная скорость роста 0,16 ч^-1; удельный съем 2,28 кг/м³/ч; выход от парафина 80,1%.

Анализ результатов проведенных исследований позволяет заключить, что предлагаемый новый термотолерантный штамм Candida tropicalis ВСБ-942 имел следующие отличительные признаки от штамма-прототипа ВСБ-928К:
- более высокий выход биомассы (практически на 4-10%) при температуре культивирования 33 ± 1^оС;
- сохранение практически на одном уровне производственно-технологических показателей как при температуре 33± 1^оС, так и при 37-38^оС;
- возможность использовать предлагаемый штамм в качестве культуры-продуцента, а не компонента смешанной культуры, в качестве которого используют штамм ВСБ-928К;
- способность роста на н-парафинах с повышенным содержанием ароматических углеводородов (до 0,6%);
- характеризуется морфологической стабильностью S-формы колоний на сусло-агаре, что коррелирует с физиологической стабильностью культуры. Кроме того, морфологическая стабильность культуры облегчает и ускоряет микробиологический контроль производства.

Использование: микробиологическая промышленность, производство кормовых дрожжей и касается нового штамма дрожжей для производства биомассы, обогащенной белком. Сущность изобретения: штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-942 получен в процессе промышленной селекции при непрерывном культивировании штамма дрожжей Candida maltosa ВСБ-899 в присутствии диких дрожжей Candida tropicalis при температуре 32-39°С на н-парафинах с содержанием ароматических углеводородов 0,01-0,8% . Штамм депонирован в коллекции ВКПМ под N У-1987. Продуктивность штамма при культивировании на н-парафинах с 0,8% ароматических углеводородов составила г/л: при температуре роста 34°С - 5,7-6,4, при температуре роста 37-38°С 5,5-6,4. Материальным признаком штамма является: ассимиляция крахмала, а также малиновый цвет колоний при росте на сусло-агаре с трифенилтетразолийхлоридом. Выход биомассы от заданного парафина составляет 103,3%, удельная скорость роста 0,33ч^-1 , содержание сырого протеина 60,1%. 6 табл.

ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA TROPICALIS - ПРОДУЦЕНТ БИОМАССЫ, ОБОГАЩЕННОЙ БЕЛКОМ.

Штамм дрожжей Candida tropicalis ВКПМ V-1987 - продуцент биомассы, обогащенной белком.