ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA FAMATA - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/16 C12P21/00 C12N1/16 C12R1/72 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штаммам дрожжей продуцентам кормовой биомассы.

Известен штамм дрожжей Candida edax (ВКПМ У-697) продуцент белковой биомассы на концентрированных гидролизных средах. Данный штамм был получен путем длительной селекции смешанных культур на концентрированных гидролизных средах. В результате культивирования дрожжей при температуре 37 39^oC, pH среды 4,2 4,5 с удельной скоростью роста 0,25 0,27 ч^-1 получают выход абсолютно сухих дрожжей от РB (редуцирующие вещества) 56% использование редуцирующих веществ 97% при концентрации РB 3% продуктивность 4,3 г/л в час, содержание общего белка в биомассе 57% истинного белка 48%
Штамм обладает высокой продуктивностью, однако узкий диапазон технологических параметров процесса культивирования (pH, температура) и способность роста только на углеводном моносубстрате существенно ограничивают область его применения.

Достигаемый в результате осуществления предложенного изобретения технический результат заключается в получении штамма дрожжей, способного расти на смешанном углеводо- и углеводородсодержащем субстрате в широком диапазоне параметров процесса культивирования при одновременном повышении его конкурентоспособности в условиях нестирильного процесса культивирования.

Указанный результат достигается за счет использования штамма дрожжей Candida famata, полученного в процессе промышленной автоселекции из числа изолятов, выделенных из биоценоза ферментора Кстовского опытно-промышленного завода белково-витаминных концентратов в период его работы на ферментолизате ржаной муки и пшеничных отрубей с добавлением н-парафинов.

Для выделения штамма дрожжевую суспензию, отобранную из ферментора, работающего в непрерывном режиме процесса культивирования в течение 3 месяцев, рассеивали на чашки Петри с сусло-агаром и отбирали изолированные колонии (изоляторы), которые далее проверяли на активность роста в колбах на качалке. В качестве углеводного субстрата использовали ферментолизат ржаной муки и пшеничных отрубей в соотношении 1:1, углеводородного н-парафина (1 об.), смешанного смесь ферментолизата с 0,2 об. н-парафинов. Температуру роста обеспечивали в интервале 34 43^oC.

Было испытано 50 изолятов, активность роста которых на ферментолизате составила 13,1 15,5 г/л абсолютно сухого вещества (АСВ), на н-парафине 1,3 13,6 г/л АСВ. 20 наиболее активных изолятов было использовано на смешанном субстрате, активность роста при этом составила 12,5 16,6 АСВ (см. таблицу).

Эти же изоляты были испытаны при различной температуре роста 37 - 43^oC, и была выявлена их толерантность, т.е. способность роста при повышенной температуре практически без снижения активности накопления биомассы.

Изолят дрожжей, имевший максимальные показатели по накоплению биомассы, был взят в качестве искомого изолята (рабочий шифр Кст. ФО 5/2-94).

Определение систематического положения отобранного штамма было проведено по монографии: Т.Н. Семушина, Н.И.Монахова, Л.А. Гусарова (Микробиологический контроль гидролизно-дрожжевого производства. М. 1975) и в соответствии с определителем дрожжей Крегер-ван-Рай (The Yeast. A taxonomyc stady. Ed. by Rreger-van-Rij. N.Y.W. Amsterdam, 1984). Установлено, что предлагаемый штамм относится к Candida famata и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки односуточной культуры на солодовом сусле (температура роста 32 34^oC) округлой формы, одиночные. Размер клеток 2,5х2,5 мкм. Аскопоры не образует. На картофельном агаре псевдомицеллий отсутствует.

Культуральные признаки. Колонии на солодовом сусло-агаре гладкие, белые с ровным краем. Штрих на солодовом сусло-агаре гладкий, ровный, беловатый. На каждом солодовом сусле кольцо слабое, пленка отсутствует, надосадочная жидкость со слабой мутью.

Физиологические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, 2-кето-глюконат, ксилозу, адонит, ксилит, галактозу, сорбозу, α -метил-D-глюкозид, N-ацетил-D-глюкозамин, мальтозу, трегалозу, мелецитозу, крахмал, парафин. Не ассимилирует: глицерин, арабинозу, инозит, целлобиозу, лактозу, раффинозу. Не сбраживает: глюкозу, раффинозу, сахарозу, лактозу, галактозу, мальтозу. Ассимилирует источники азота: сульфат аммония, аспарагиновую кислоту, пентон, мочевину (оч. слабо), нитрат калия (оч.слабо). В витаминах не нуждается при росте на углеводном субстрате. При выращивании на н-парафинах активность роста увеличивается при добавлении 0,5 об. дрожжевого авитолизата.

В результате санитарно-гигиенических исследований установлена непатогенность штамма.

Штамм Candida famata (Кст. ФО 5/2-94) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером У-2207.

Штамм Candida famata испытан в камеральных условиях периодического и непрерывного процессов культивирования в широком диапазоне pH среды (3,5 - 7,2), температуры роста 30 43^oC на ферментолизате муки и отрубей (при различном из соотношении), а также смешанном субстрате (ферментолизате с добавлением н-парафинов). Конкурентоспособность штамма в условиях нестерильного процесса выращивания оценивали путем высева суспензии на сусло-агар (чашки Петри), культивирования в течение 3 5 суток при температуре 43^oC и определения морфологии выросших колоний.

Пример 1. Штамм дрожжей Candida famata культивировали в периодическом режиме в аппарате "Абитекс" (рабочий объем 5,0 л) с автоматическим обеспечением температуры 30^oC, pH среды 3,5 при частоте перемешивания 900 об/мин и подаче воздуха 420 л/ч. Субстратом служил ферментолизат пшеничных отрубей, который готовили следующим образом: 5%-ную суспензию отрубей нагревали до 55 60^oC, добавляли в нее 0,5% фермента амилосубтилина и выдерживали в течение одного часа при перемешивании. Минеральное питание обеспечивали добавлением на 5 л среды (ферментализатора) 20 мл 20%-ного раствора сульфата аммония и 100 мл концентрированных солей следующего состава, г/л: H₃PO₄ (70%-ная) 52 мл; KCl 49; MgSO₄•7H₂O 35; FeSO₄•7H₂O 6,7; ZnSO₄•7H₂O 1,45; MnSO₄•7H₂O 0,85. Состав ферментолизата: азот общий 1,7% (на ABC), общие углеводы (определение фенольным методом) 80,7 г/л, редуцирующие вещества 13,1 г/л (без инверсии) и 30,2 г/л (с инверсией). Продолжительность процесса культивирования составила 8 часов. Содержание общих углеводов в культуральной среде в конце процесса 11,5 г/л, редуцирующих веществ (без инверсии) 0,5 г/л, т.е. потребление общих углеводов составило 85,7% и редуцирующих веществ 96,2% Содержание сырого протеина в готовом продукте 31,9% Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 100%
Пример 2. Штамм дрожжей Candida famata культивировали в непрерывном режиме (удельная скорость роста Д 0,125 ч.^-1) в аппарате рабочим объемом 12 л на 14%-ном ферментолизате (ржаная мука 70% пшеничные отруби 30%). Ферментолиз вели с добавлением 0,5% амилосубтилина при температуре 65 - 70^oC в течение 2 часов при перемешивании. Минеральное питание осуществляли подачей раствора солей, г/л: аммофос 125; сульфат аммония 20; сульфат железа 3,6; сульфат цинка 1,6; сульфат марганца 0,8. Дополнительно при необходимости добавляли сульфат железа в концентрации 6,6 г/л. Титрование проводили 6%-ным раствором аммиака. Остаточное содержание в культуральной среде составляло, мг/л: азот 500 1000; фосфор 250 500; железо 20 40; калий 200 400; цинк до 10, магний 100 200; марганцец до 10. Условия выращивания: pH среды 5,5, температура 35^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в подаваемом ферментолизате составляло 94,5 г/л и 46,0 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде составляло 7,3 и 5,0 соответственно, т.е. потребление общих углеводов и глюкозы составило 92,3% и 89,1% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте 26% сырого протеина 45% Расходный коэффициент (субстрат/готовый продукт) 1,2. Продуктивность 12,5 г/л в час. Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 90%
Пример 3. Штамм дрожжей Candida famata культивировали по примеру 2, но pH среды был 4,5, температура роста 43^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в поступающем на культивирование ферментолизате составило 95 г/л и 53 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде 11 г/л и 2 г/л соответственно, т.е. потребление общих углеводов составило 88,4% и глюкозы 96,2% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте 25% сырого протеина 43% Расходный коэффициент 1,4. Продуктивность 10,1 г/л в час. Доминирование штамма в биоценозе) составило 100%
Пример 4. Штамма дрожжей Candida famata культивировали по примеру 2, но pH среды был 7,2, температура роста 39^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в поступающем на культивирование ферментолизате составило 91 г/л и 56 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде составило 6 г/л, т.е. потребление общих углеводов составило 83,4% и глюкозы 89,3% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте составило 25% сырого протеина 40,9% Расходный коэффициент 1,5. Продуктивность 10,9 г/л в час. Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 100%
Пример 5. Штамм дрожжей Candida famata культивировали по примеру 2, но в качестве субстрата использовали ферментолизат пшеничных отрубей (12%) и н-парафинов (2,18 г/л). pH среды 5,0, температура роста 39^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в подаваемом на культивирование ферментолизате составило 60,5 г/л и 22,2 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде составило 10,1 г/л и 5,2 г/л, т.е. потребление общих углеводов и глюкозы было 83,3% и 76,5% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте составило 26,5% сырого протеина 42% Расходный коэффициент 1,5. Продуктивность 9,7 г/л в час. Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 95%
Пример 6. Штамм Candida famata культивировали в непрерывном процессе в промышленном ферментере рабочим объемом 400 м³ в течение месяца с удельной скоростью роста 0,12 ч.^-1 на 14% ферментолизате ржаной муки (70%) и пшеничных отрубей (30%), полученном при обработке 0,5% амилосубтилином при 65 70^oC в течение 3-х часов при перемешивании. Условия выращивания: pH среды 4,0 4,2, температура 35 39^oC. Минеральное питание осуществляли по примеру 2. Содержание общих углеводов и глюкозы в поступающем на выращивание ферментолизате составляло 76 101 г/л и 40 48 г/л соответственно. Остаточное содержание азота в культуральной среде находилось в пределах 1500 3000 мг/л, фосфора 80 400 мг/л, общих углеводов 0,4- 1,7 г/л. Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте составило 30% сырого протеина 45% Расходный коэффициент 1,4. Продуктивность 13,3 г/л в час. Уровень сопутствующей бактериальной обсеменности на стадии ферментации был 10⁵ 10⁸ кл/мл, в готовом продукте 1•10⁴ кл/г. Доминирование (конкурентоспособность) штамма 100%
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что штамм Candida famata способен расти на смешанном углеводо-углеводородсодержащем субстрате в широком диапазоне параметров процесса культивирования (pH среды 3,5 7,2; температура 30 43^oC), обладая при этом повышенной конкурирующей способностью в условиях нестерильного процесса культивирования.

Предложенное изобретение является новым, так как указанный штамм-продуцент кормового белка из уровня техники не известен.

Оно имеет изобретательский уровень, поскольку возможность получения указанного технического результата с использование штамма дрожжей Candida famata явным образом не следует из уровня техники.

Промышленная применимость изобретения подтверждена экспериментально.

Таким образом, данное изобретение удовлетворяет всем условиям патентоспособности.

Использование: биотехнология для получения белковой биомассы. Сущность: новый штамм дрожжей Candida famata ВКПМ У-2207, способный расти на смешанном углеводо-углеводородсодержащем субстрате в широком диапазоне параметров процесса (pH, температура) и обладающий высокой продуктивностью по биосинтезу белка, в результате чего повышена его конкурентоспособность по сравнению с аналогичными штаммами того же назначения. 1 табл.

Штамм дрожжей Condida famata ВКПМ Y-2207 продуцент белковой биомассы.