СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ УРЕАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N11/08 C08J5/20 

Изобретение относится к области высокомолекулярных соединений, а именно к получению полимерных биокатализаторов для разложения мочевины в водных растворах путем иммобилизации фермента уреазы на полимерном носителе.

Полученная по предлагаемому способу иммобилизованная уреаза может использоваться для количественного удаления мочевины из биологических жидкостей и сточных вод, в которых наряду с мочевиной присутствуют другие соединения. Высокая стабильность каталитических свойств позволяет использовать полученную иммобилизованную уреазу в самых различных условиях, включая повышенные температуры и повышенные значения рН среды.

Известен способ иммобилизации ферментов практически всех классов, в том числе и уреазы, на носителях, в качестве которых используются аниониты, отличающиеся удельной поверхностью и размером пор, в качестве активных групп-диэтиламиноэтильные. Существенным недостатком известного способа является низкая термостабильность продуктов, что накладывает серьезные ограничения на использование их в широкой практике.

Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации уреазы путем обработки 1% водным раствором уреазы при рН 6,5-7,5 хлорметилированного макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, который предварительно активирован взаимодействием с водным раствором триметиламина, и последующей обработкой иммобилизованного препарата 0,1-0,5% водным раствором глутарового альдегида. Биокатализаторы, полученные по известному способу, имеют высокую каталитическую активность (10-30 ед. Самнера/г), однако существенным недостатком известного способа является низкая термостабильность продуктов и, как следствие этого, необходимость их хранения при температуре не выше 10^оС. При значениях рН биологических жидкостей и сточных вод от 8,0 и выше в диапазонах температур 40-60^оС, т.е. в часто встречающихся условиях реальной эксплуатации, имеют место значительная десорбция фермента с полимерного носителя, что приводит к загрязнению очищаемой жидкости белком, а также снижает удельную каталитическую активность препаратов более чем в 10 раз. Большой расход дорогостоящего ферментного препарата (до 210 мг на 1 г продукта) и, как следствие этого, высокая стоимость продуктов, значительно ограничивают применение в широкой практике биокатализаторов, полученных по известному способу.

Целью изобретения является повышение термостабильности целевого продукта, снижение расхода фермента и возможности использования целевого продукта в широком диапазоне рН.

Поставленная цель достигается тем, что иммобилизацию уреазы проводят обрабатывая водным раствором уреазы предварительно активированный макропористый хлорметилированный сополимер стирола с дивинилбензолом и последующем взаимодействием его с водным раствором глутарового альдегида, при этом активацию хлорметилированного макропористого сополимера проводят обработкой трипропилфосфином и водным раствором гидроксида щелочного металла.

Это позволяет значительно (более чем в 5 раз) снизить удельный расход дорогостоящего фермента, а также получить препараты с иммобилизованной уреазой с высокой термостабильностью. Это подтверждается тем, что при испытании каталитическая активность прототипа снижалась более чем на порядок, а для препаратов, полученных по предлагаемому способу, наблюдалось снижение активности на 7-8%.

В предлагаемом способе использовались макропористые сополимеры стирола и дивинилбензола, полученные по реакции радикальной сополимеризации в присутствии инертного растворителя, в качестве которого используют гептан, декан, бензин БЛХ и т.п. Сополимеры содержат 10-30 мас.% дивинилбензола, 90-70 мас. % стирола, 50-160% от массы мономеров инертного растворителя. Хлорметилирование проводят по стандартной методике обработкой сополимера монохлордиметиловым эфиром в присутствии катализатора. Содержание Cl в продукте 15-20%. Обработку хлорметилированного сополимера трипропилфосфином проводят при температуре 140^оС в течение 10 ч в атмосфере азота. После охлаждения продукт промывают дистиллированной водой, экстрагируют ацетоном, высушивают в вакууме. Продукт представляет собой гранулы желтого цвета, содержащие 9-10% фосфора.

Оценка каталитической активности иммобилизованного препарата проводилась известным способом по аттестованной методике (ТУ 6-06-54-89).

П р и м е р 1. В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и обратным холодильником, загружают 20 г макропористого сополимера стирола с дивинилбензолом марки 12/80 (12 мас.% дивинилбензола, 88 мас.% стирола, 80% от массы мономеров инертного растворителя гептана), заливают 70 мл монохлордиметилового эфира, оставляют для набухания на 1 ч, приливают 9 мл четыреххлористого титана, при температуре 45^оС перемешивают в течение 7 ч, отмывают метилалем до нейтральной реакции по метилоранжу, высушивают в вакууме. Содержание Cl - 17,2%. Хлорметилированный сополимер помещают в круглодонную колбу, приливают 35 г трипропилфосфина и оставляют для набухания в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем температуру поднимают до 140^оС и выдерживают в течение 15 ч при перемешивании в атмосфере азота. После охлаждения продукт промывают водой, экстрагируют ацетоном, высушивают в вакууме.

Обрабатывают 300 мл 1%-ного раствора КОН в течение 2 ч при комнатной температуре, отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по фенолфталеину. Содержание Cl составляет 6,35%, содержание фосфора 9,5%. 5 г полученного продукта обрабатывают 80 мл 0,25% -ного раствора уреазы (активность фермента 478 ФЕ/мг) в течение 2 ч, затем подвергают взаимодействию с 50 мл 0,25%-ного раствора глутарового альдегида в течение 1 ч и отмывают дистиллированной водой до отсутствия в фильтрате следов белка и глутарового альдегида.

П р и м е р 2. По примеру 1, но с использованием макропористого сополимера структуры 15/100 (15 мас.% дивинилбензола, 85 мас.% стирола, 100% от массы мономеров инертного растворителя декана) и обработкой 300 мл 1%-ного раствора NaOH. Содержание Cl составляет 6,29% содержание фосфора 9,56%.

П р и м е р 3. По примеру 1, но с использованием макропористого сополимера структуры 20/120 (20 мас.% дивинилбензола, 80 мас.% стирола, 120% от массы мономеров инертного растворителя бензина БЛХ). Содержание Cl составляет 6,17%, содержание фосфора 9,18%.

Характеристики биокатализаторов с иммобилизованной уреазой, данные по удельному расходу фермента и термостабильности представлены в таблице.

Использование: разложение мочевины в водных растворах. Сущность изобретения: иммобилизацию проводят обработкой активированного макропористого хлорметилированного сополимера стирола и дивинилбензола водным раствором уреазы и последующим взаимодействием с водным раствором глутарового альдегида. Активацию сополимера проводят последовательной обработкой трипропилфосином и водным раствором гидроксида щелочного металла. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ УРЕАЗЫ, предусматривающий активацию макропористого хлорметилированного сополимера стирола и дивинилбензола, обработку его раствором фермента и последующее взаимодействие полученного препарата с глутаровым альдегидом, отличающийся тем, что, с целью повышения термостабильности целевого продукта и снижения расхода фермента, активацию макропористого хлорметилированного сополимера стирола и дивинилбензола проводят последовательной обработкой его трипропилфосфином и водным раствором гидроксида щелочного металла.