СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, и может быть использовано для прогнозирования течения бронхиальной астмы.

Известен способ прогнозирования течения бронхиальной астмы, включающий клиническое обследование больных, забор крови у больных, получение фракции лейкоцитов и плазмы (бедной тромбоцитами) в лейкоцитах методом хемилюминесценции, определение интенсивности генерации активных форм кислорода, индуцируемой двуокисью кремния в системе с люминолом, а в плазме определение малоново-диальдегидоподобных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и антиперекисной активности плазмы по тушению Н₂О₂ индуцируемой хемилюминесценции и расчет прогностического коэффициента по формуле:
K=AxBxCx880, где К прогностический коэффициент;
А интенсивность SiO₂ стимулированной хемилюминефценции в расчете на лейкоцит, имп/с.лейкоцит;
В содержанием малоново-диальдегидоподобных продуктов в плазме, мкМ/л,
С отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии и отсутствии перекиси водорода,
880 числовой коэффициент, и при значении К, большем 3500, прогнозируют тяжелое течение болезни, а при К, меньшем 3100, легкое или среднетяжелое течение болезни.

Способ обладает точностью до 92%
Цель изобретения повышение точности прогнозирования течения бронхиальной астмы за счет дополнительного введения количественного диагностического показателя.

Для этого способ прогнозирования течения бронхиальной астмы включает клиническое обследование больных, забор крови у больных, получение фракции лейкоцитов и плазмы (бедной тромбоцитами), в лейкоцитах методом хемилюминесценции определение интенсивности генерации активных форм кислорода, индуцируемой двуокисью кремния в системе с люминолом, в плазме определение малоново-диальдегидоподобных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и антиперекисной активности плазмы по тушению Н₂О₂ индуцируемой хемилюминесценции.

Отличие способа от известных заключается в том, что выделяют плазму, обогащенную тромбоцитами, и путем сравнения изменения хемилюминесцентным методом интенсивности генерации активных форм кислорода лейкоцитами после добавления плазмы, бедной тромбоцитами, и плазмы, обогащенной тромбоцитами, в системе с люминолом определяют ингибирующую активность тромбоцитов и рассчитывают прогностический показатель по формуле:
K × 880, где К прогностический коэффициент,
А интенсивность SiO₂, стимулированной хемилюминесценции, в расчете на лейкоцит, имп/с. лейкоцит,
В содержание малоново-диальдегидоподобных продуктов в плазме, мкМ/л,
С отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии Н₂О₂ к аналогичной величине в отсутствии Н₂О₂,
Т коэффициент ингибирующего влияния тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами,
880 числовой коэффициент и при значении К, большем либо равном 2885, прогнозируют тяжелое течение болезни, а при К, меньшем либо равном 2825, легкое или среднетяжелое течение болезни.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Определение интенсивности генерации активных форм кислорода лейкоцитами крови.

У больных утром натощак из локтевой вены забирают 10-12 мл крови в заранее приготовленную пробирку. Кровь отстаивают в течение 1,5 ч при 4^оС. При этом кровь разделяется на три слоя: нижний эритроциты, верхний плазма, средний -тонкая белесоватая пленка (лейкоциты). Собирают тонкую пленку лейкоцитов и часть плазмы. Полученную суспензию центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, затем плазму сливают. Осадок представляет собой лейкоцитарную массу. При необходимости проводят осмолизис эритроцитов. Для этого к лейкомассе прибавляют 6 мл дистиллированной воды с рН 7,35 и ресуспендируют клетки; не более чем через 10 с после добавления дистиллированной воды к суспензии приливают 2 мл 3,6%-ного раствора хлорида натрия с рН 7,35 для прекращения осмолизиса. Полученную взвесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливают. При необходимости осадок из лейкоцитарных клеток еще раз отмывают физиологическим раствором с рН 7,35. Осадок из клеток суспендируют в 1 мл физиологического раствора с рН 7,35. Забирают 0,02 мл образовавшейся лейкоцитарной взвеси для дифференциального подсчета количества лейкоцитов. После подсчета клеток дополнительно разводят суспензию физиологическим раствором таким образом, чтобы в 1 мл находилось 2,5 млн лейкоцитов. В хемилюминометр помещают стандартный объем лейкомассы 0,2 мл со стандартным общим количеством лейкоцитов, равным 500 000.

Генерацию активных форм кислорода лейкоцитами крови исследуют методом люминолозависимой хемилюминесценции. В качестве хемилюминометра использовали адаптированный радиометр "Роботрон" N 20046. Определяют уровень базальной хемилюминесценции стандартного объема лейкомассы 0,2 мл со стандартной концентрацией лейкоцитов (2500 лейкоцитов в 1 мкл) после добавления 0,02 мл насыщенного изоосмолярного раствора люминола рН 7,35 и интенсивность их хемилюминесцентного ответа на стимуляцию 0,1 мл 1%-ного раствора SiO₂ (размер частиц как правило 3 мк). Рассчитывают показатель интенсивности хемилюминесценции (ПИХЛ), стимулированной SiO₂по формуле
ПИХЛ
Таким образом, получают первое значение формулы (А) интенсивность SiO₂ стимулированной хемилюминесценции в расчете на лейкоцит.

2. Определение малоново-диальдегидоподобных продуктов в плазме крови.

Сущность реакции заключается во взаимодействии тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с вторичной плазмой (плазмой бедной тромбоцитами) и последующем добавлении Н-бутанола для экстракции окрашенного ТБК-продукта. К 1,5 мл ТБК добавляют 1 мл плазмы и подогревают в кипящей водяной бане 10-15 мин (до появления розовой окраски). После охлаждения до комнатной температуры в пробирку добавляют 3 мл Н-бутанола для экстракции окрашенного ТБК-продукта и экстрагируют 10-15 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант отсасывают и измеряют оптическую плотность при длине волны 532 нм (контроль дистиллированная вода 1 мл и ТБК 1,5 мл). Концентрацию малоново-диальдегидоподобных продуктов рассчитывают по формуле:
C D × , где D оптическая плотность, р степень разведения, 1,56 поправочный коэффициент. Результат выражают в мкМ/л.

3. Методика определения антиперекисной активности плазмы.

Методика основана на измерении и сопоставлении показателей индуцированной перекисью водорода хемилюминесценции плазмы, бедной тромбоцитами, и ее спонтанной хемилюминесценции. Рассчитывают отношение между ними в относительных единицах. Исследование проводится на адаптированном радиометре "Роботрон" N 20046. Спонтанная хемилюминесценция плазмы отражает хемилюминесцентный ответ плазмы в покое. Индуцированная хемилюминесценция плазмы отражает хемилюминесцентный ответ плазмы после добавления 0,05 мл 3%-ного раствора Н₂О₂.

4. Определение ингибирующего влияния тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами крови.

Суспензию из лейкоцитов и части плазмы, полученную после того, как кровь отстояла 1,5 ч (см. п.1), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, затем плазму сливают. Полученная плазма обогащена летромбоцитами. В дальнейшем плазму центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин и получают плазму, бедную тромбоцитами. На адаптированном радиометре "Роботрон" N 20046 определяют уровень базальной хемилюминесценции стандартного объема лейкомассы 0,2 мл со стандартной концентрацией лейкоцитов 2500 в 1 мкл после добавления 0,02 мл насыщенного изоосмолярного раствора люминола рН 7,35 и дельту их хемилюминесценции после добавления плазмы, обогащенной тромбоцитами (50 мкл), или плазмы, бедной тромбоцитами (50 мкл). Отношение дельты хемилюминесценции лейкоцитов после добавления плазмы, бедной тромбоцитами, к дельте хемилюминесценции лейкоцитов после добавления плазмы, обогащенной тромбоцитами, представляет собой коэффициент ингибирующего влияния тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами (Т).

Способ иллюстрируется следующим конкретными примерами.

П р и м е р 1. Больной К. 49 лет, и/б N 7854/371, поступил в ГТК ММА им. И. М. Сеченова 20.03.1992 г. с жалобами на приступы удушья, приступообразный кашель с отделением мокроты светлого цвета, одышку при физической нагрузке. Из анамнеза известно, что около 10 лет страдает хроническим бронхитом. В последние годы госпитализировался 2-3 раза в год. Проводилось лечение эуфиллином, теофедрином, алоэ с умеренным эффектом. С 1988 г. установлен диагноз бронхиальная астма. В связи с недостаточно эффективной терапией госпитализирован для обследования и лечения. Состояние при поступлении удовлетворительное. В легких на фоне жесткого дыхания и удлиненного выхода выслушиваются сухие хрипы. ЧД= 20 в мин. Тоны сердца ритмичные. Пульс=64 уд/мин. АД 120/70 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. Общ.ан.крови: Э-4,9 х 10⁶, Л-5,6 х х10³, эозинофилы 2,5% СОЭ 5 мм/час. Был поставлен диагноз: бронхиальная астма, инфекционно-аллергическая форма, легкого течения, в фазе среднетяжелого обострения. 20.03.1990 г у больного взята кровь. Выделена лейкоцитарная масса и плазма, обогащенная и бедная тромбоцитами. Определен показатель интенсивности SiO₂ стимулированной хемилюминесценции (А=0,164 имп/с лейкоцит) путем сравнения изменения хемилюминесцентным методом интенсивности генерации активных форм кислорода лейкоцитами крови после добавления плазмы, бедной тромбоцитами, и плазмы, обогащенной тромбоцитами, определен коэффициент ингибирующей активности тромбоцитов (Т=6,1) и отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы, бедной тромбоцитами, в присутствии Н₂О₂ к аналогичной величине в отсутствии Н₂О₂ (С=15,3). В плазме, бедной тромбоцитами, определено количество малоново-диальдегидоподобных продуктов (В=7,97 мкМ/л). Полученные данные введены в формулу:
K × 880
K · 880 2885
Вычисленный результат (2885) соответствует тяжелому течению и в дальнейшем позволяет прогнозировать тяжелое течение болезни. В последующие 8 месяцев больного несколько раз беспокоили тяжелые приступы удушья, что подтверждает прогноз тяжелого течения болезни.

П р и м е р 2. Больная М. 52 года, и/б N 15758/745, поступила в ГТК ММА им. И.М.Сеченова 05.06.1990 г, с жалобами на приступы удушья, кашель с трудноотделяемой мокротой, одышку при физической нагрузке. Из анамнеза известно, что много лет страдает хроническим бронхитом, частыми острыми пневмониями. Удушение с января 1990 г. после перенесенной ангины: усилился кашель, к нему присоединились приступы удушья, которые прогрессивно учащались, одновременно усилилась одышка, в горизонтальном положении четкое свистящее дыхание. При поступлении состояние удовлетворительное. Дыхание в легких жесткое, выдох удлинен, много сухих свистящих хрипов. ЧД=22 в мин. Тоны сердца ритмичны. Пульс 82 уд/мин. АД120/70 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Общ. ан. крови: Э 4,6 х 10⁶, Л-7,4х х 10³, эозинофилы 2,5% СОЭ 11 мм/ч. Был поставлен диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, средней тяжести в фазе среднетяжелого обострения. 06.06.1990 г. была взята кровь. Выделена лейкоцитарная масса и плазма. Определен показатель интенсивности SiO₂стимулированной хемилюминесценции (А 0,0793 имп/с,лейкоцит), показатель ингибирующей активности тромбоцитов (Т 0,87) и отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии Н₂О₂ к аналогичной величине в отсутствии Н₂О₂ (С 6,8). В плазме определено количество малоново-диальдегидоподобных продуктов (В5,18 мкМ/л). Полученные данные введены в формулу
K × 880
K · 880 2825
Вычисленный результат (2825) соответствует легкому или среднетяжелому течению и в дальнейшем позволяет прогнозировать легкое или среднетяжелое течение. В дальнейшем у больной тяжелых приступов удушья не было.

П р и м е р 3. Больной М. 43 г. и/б N 14384/685, поступил в ГТК ММА им. И.М.Сеченова 22.05.1990 г. с жалобами на приступы удушья, снимающиеся на некоторое время беротеком, кашель со скудной мокротой желтоватого цвета. Из анамнеза известно, что в течение 15 лет периодически беспокоит кашель с легко отделяемой мокротой беловато-желтоватого цвета. Был поставлен диагноз хронического бронхита. В 1989 г. на фоне очередного обострения заболевания появились приступы удушья. Лечился в стационаре миолитиками, симпатомиметиками, инталом. Последнее ухудшение с декабря 1989 г. когда участились приступы удушья и кашля с мокротой. При поступлении больной нормального телосложения, пониженного питания, кожные покровы и видимые слизистые нормальной окраски. Дыхание затруднено. ЧД 20 в мин. Аускультативно дыхание ослаблено, сухие хрипы выслушиваются в большом количестве. Тоны сердца приглушены. АД 120/80 мм. рт. ст. Пульс 76 уд/мин. Живот мягкий, безболезненный. Общ.ан. крови: Э 4,6х10⁶, Л 5,7 х10³, эозинофилы 8% СОЭ 5 мм/час. Был поставлен диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, среднетяжелого течения в фазе среднетяжелого обострения. 24.05.1990 г. утром натощак у больного взята кровь. Выделена лейкоцитарная масса и плазма. Определен показатель интенсивности стимулированной хемилюминесценции (А 0,088 имп/с.лейкоцит), коэффициент ингибирующей активности тромбоцитов (Т 1,4) и отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии Н₂О₂ к аналогичной величине в отсутствии Н₂О₂ (С 9,7). В плазме также определено количество малоново-диальдегидоподобных продуктов (В 5, 88 мкМ/л). Полученные данные введены в формулу:
K × 880
K · 880 3155
Вычисленный результат (3155) соответствует тяжелому течению и в дальнейшем позволяет прогнозировать тяжелое течение болезни. 28.05.1990 г у больного развился тяжелый астматический приступ, астматическое состояние, купировавшееся в/в влиянием эуфиллина 2,4% 10,0 и преднизолона 60 мг.

П р и м е р 4. Больной С. 46 лет и/б N 15092/713, поступил в ГТК ММА им. И. М.Сеченова 30.05.1990 г. с жалобами на приступы удушья, кашель с мокротой в скудном количестве, одышку при ходьбе. В анамнезе с 1972 г. хронический бронхит. С 1986 г. приступы удушья диагностирована бронхиальная астма. Неоднократно лечился в стационаре эуфиллином, теофедрином, а с 1988 г глюкокортикоидами с кратковременным эффектом. При поступлении состояние удовлетворительное. Дыхание затруднено. ЧД 22 в мин. Аускультативно дыхание ослаблено, сухие хрипы выслушиваются в большом количестве. Тоны сердца приглушены. Пульс 78 уд/мин. АД130/80 мм рт.ст. Общ. ан.крови: Э 4,2 х 10⁶, Л 6,4 х 10³, эозинофилы 5,5% СОЭ 25 мм/час. Был поставлен диагноз: бронхиальная астма, гормонозависимая, среднетяжелого течения в фазе среднетяжелого обострения. 31.05.1990 г. была взята кровь. Выделена лейкоцитарная масса и плазма. Определен показатель интенсивности SiO₂, стимулированной хемилюминесценции (А 0,039 имп) с.лейкоцит), коэффициент ингибирующей активности тромбоцитов (Т 1,1) и отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии Н₂О₂ к аналогичной величине в отсутствии Н₂О₂ (С 21,0). В плазме также определено количество малоново-диальдегидоподобных продуктов (В 4,3 мкМ/л). Полученные данные введены в формулу:
K × 880
K · 880 2817
Вычисленный результат (2817) соответствует легкому или среднетяжелому течению и в дальнейшем позволяет прогнозировать легкое или среднетяжелое течение. В дальнейшем у больного тяжелых приступов удушья не было.

П р и м е р 5. Больная Н. 52 г. и/б N 13936, поступила в ГТК ММА им.И.М. Сеченова 18.05.1990 г. с жалобами на сухой кашель, приступы удушья 2-3 раза в сутки, одышку при физической нагрузке. Из анамнеза известно, что много лет страдает хроническим бронхитом. С 1989 г. появились приступы удушья, которые остаются до настоящего времени. Был поставлен диагноз бронхиальной астмы, который в дальнейшем был подтвержден в стационаре, где с положительным результатом применялась глюкокортикоидная терапия. Отмена ее привела к очередному обострению. Состояние при поступлении удовлетворительное. В легких на фоне жесткого дыхания и удлиненного выдоха выслушиваются сухие хрипы. ЧД 22 в мин. Тоны сердца ритмичные. Пульс 72 уд/мин. АД 130/80 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Общ. ан.крови: Э 4,3 х 10⁶, Л 8,4 х 10³, эозинофилы 12% СОЭ 10 мм/ч. Был поставлен диагноз: бронхиальная астма, гормонозависимая, тяжелого течения в фазе среднетяжелого обострения. 19.05.1990 г у больной взята кровь. Выделена лейкоцитарная масса и плазма. Определен показатель интенсивности стимулированной хемилюминесценции (А 0,358 имп/с.лейкоцит), показатель ингибирующей активности тромбоцитов (Т 0,6) и отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии Н₂О₂ к аналогичной величине в отсутствии Н₂О₂ (С 3,9). В плазме определено количество малоново-диальдегидоподобных продуктов (В 4,37 мкМ/л). Полученные данные введены в формулу:
K × 880
K · 880 8949
Вычисленный результат (8949) соответствует тяжелому течению и в дальнейшем позволяет прогнозировать тяжелое течение болезни. В последующие 6 месяцев больную несколько раз беспокоили тяжелые приступы удушья, что подтверждает прогноз тяжелого течения.

Предлагаемый способ прогнозирования течения бронхиальной астмы может быть использован в специализированных стационарах. Способ позволяет дать прогноз в течение 1-2 ч.

Обоснование параметра: параметр 2885 берут за границу между тяжелым течением, с одной стороны, и легким и среднетяжелым течением, с другой стороны, потому, что у 100% исследованных больных с подтвержденным тяжелым течением показатель К был свыше или равным 2885, а у 87,5% больных с подтвержденным легким или среднетяжелым течением показатель К был равным или меньше 2825. Таким образом, точность предлагаемого метода для тяжелого течения 100% для среднетяжелого и легкого течения 87,5% в среднем 94%
Прогностический коэффициент в зависимости от тяжести течения бронхиальной астмы дан в таблице.

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии бронхолегочных заболеваний. Сущность изобретений: у больных берут пробу крови, получают фракцию лейкоцитов и плазму, обогащенную и бедную тромбоцитами, затем в лейкоцитах определяют хемилюминесцентным методом интенсивность генерации активных форм кислорода, индуцируемой двуокисью кремния в системе с люминолом, затем в плазме, бедной тромбоцитами, определяют малоново-диальдегидоподобные продукты и антиперекисную активность плазмы по тушению H₂O₂- индуцируемой хемилюминесцензии, сравнивают изменения хемилюминесцентным методом интенсивности генерации активных форм кислорода лейкоцитами после добавления плазмы, бедной тромбоцитами, и плазмы, обогащенной тромбоцитами, и рассчитывают прогностический показатель по формуле где K - прогностический показатель; A - интенсивность стимулированной двуокисью кремния хемилюминесценции в расчете на лейкоцит, имп/с. лейкоцит; B - содержание малоново-диальдегидоподобных продуктов в плазме, мкМ/л; C - отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии перекиси водорода и ее отсутствии; T - коэффициент ингибирующего влияния тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами крови; 880 - числовой коэффициент, и при значении этого показателя, равном 2885 и более, прогнозируют тяжелое течение, а при значении, равном 2885 и менее, - легкое и среднетяжелое течение болезни. 1 табл.

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ, включающий клиническое обследование больных, отличающийся тем, что у больных производят забор крови, получают фракцию лейкоцитов и плазму, обогащенную и бедную тромбоцитами, затем в лейкоцитах методом хемилюминесценции определяют интенсивность генерации активных форм кислорода лейкоцитами, индуцируемой двуокисью кремния в системе с люминолом, а в плазме, бедной тромбоцитами, определяют малоново-диальдегидроподобные продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, и ее антиперекисную активность по тушению H₂O₂-индуцируемой хемилюминесценции, сопоставляют хемилюминесценцию лейкоцитов после добавления плазмы, бедной тромбоцитами, и плазмы, обогащенной тромбоцитами, и рассчитывают прогностический показатель по формуле

где K прогностический показатель;
A интенсивность стимулированной двуокисью кремния хемилюминесценции в расчете на лейкоцит, имп/с · лейкоцит;
B содержание малоново-диальдегидоподобных продуктов в плазме, мкМ/л;
C отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии перекиси водорода и ее отсутствии;
T коэффициент ингибирующего влияния тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами крови;
800 числовой коэффициент,
и при значении этого показателя, равном 2885 и более, прогнозируют тяжелое течение, а при значении, равном 2825 и менее, легкое или среднетяжелое течение болезни.