СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК A61K31/557 

Изобретение относится к медицине и может найти применение для купирования состояний, сопровождающихся повышением адгезивно-агрегационных свойств тромбоцитов и для консервирования обогащенной тромбоцитами плазмы.

Поиск ингибиторов агрегации тромбоцитов, обладающих выраженным эффектом при болюсном введении в организм, представляет большой интерес для неотложной помощи больным с повышенной агрегационной способностью тромбоцитов (инфаркт миокарда, ишемия мозга и др.).

Цель изобретения средство, эффективно снижающее агрегационную активность тромбоцитов при болюсном введении, обладающее высокой стабильностью при хранении и низкой способностью к биотрансформации в организме.

Поставленная цель достигается применением в качестве средства, снижающего агрегацию тромбоцитов, известного соединения 5-окса-6-кето-простагландина Е₁. Сведения о биологической активности в литературе отсутствуют.

Для выявления in vitro антиагрегационной активности свежеприготовленных растворов 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ в качестве проагрегантов использовали АДФ в концентрациях 10^-5 М и 2 ˙ 10^-7 М в конечной смеси, коллаген в концентрации 14 мкг/мл и адреналин в концентрации 2,5-5 мкг/мл. Богатую тромбоцитами плазму получали путем центрифугирования стабилизированной 3,8% раствором цитрата натрия крови здоровых доноров в течение 10 мин при 1000 об/мин. Агрегацию тромбоцитов регистрировали на агрегометре фирмы Chronolog Corporation (США). Степень агрегции выражали в процентах падения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы после окончания реакции по сравнению с исходным уровнем. Результаты эксперимента показали, что при исполь- зовании в качестве проагреганта АДФ в концентрации 2 ˙ 10^-7 М (табл.1) 5-окса-6-кето-простагландин Е₁ уже в количестве 0,001 мкг/мл конечной смеси существенно снижал агрегацию тромбоцитов in vitro. При увеличении количества добавляемого простаноида антиагрегационный эффект его возрастал. Агрегация тромбоцитов, индуцированная коллагеном (табл.2), существенно снижалась, если к пробе добавлен 5-окса-6-кето-простагландин Е₁ в количестве 0,01 мкг/мл и практически полностью блокировалась при увеличении концентрации изучаемого агента до 0,1 мкг/мл. Адреналин зависимая агрегация (табл.3) снижалась примерно на 20% при внесении в кювету простаноида в количестве 0,01 мкг/мл и в два раза при увеличении концентрации 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ до 0,1 мкг/мл. Примерно такой же активностью обладало это вещество и при индукции агрегации АДФ 10^-5 М (табл.4).

Таким образом, результаты проведенной работы показали, что 5-окса-6-кето-простагландин Е₁ обладает выраженным антиагрегационным эффектом in vitro.

Для выявления антиагрегационной активности 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ ex vivo свежеприготовленный раствор данного вещества вводили кроликам в краевую вену уха в количестве 1 мкг/кг, 2 мг/кг или 5 мг/кг веса животного. Кровь забирали методом свободного падения капель до введения вещества, через 15, 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мин после введения простаноида и стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. В полученной из данных проб богатой тромбоцитами плазме определяли агрегационную активность тромбоцитов, используя в качестве индуктора АДФ 10^-5 М.

Результаты исследования, представленные в табл.5, позволили сделать вывод о высокой эффективности 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ как антиагрегационного средства. Так, даже при введении в дозе 1 мг/кг веса животного это вещество достоверно снижало агрегацию тромбоцитов кроликов в течение 30 мин. С увеличением количества вводимого простаноида до 2 мг/кг веса продолжительность эффекта после однократного введения увеличивалась до двух часов, а сила эффекта, особенно на протяжении первых 30 мин, существенно возрастала. Дальнейшее увеличение дозы вводимого агента до 5 мг/кг не увеличивало по продолжительности антиагрегационное действие препарата, но выраженность этого эффекта была такова, что агрегация тромбоцитов ex vivo в первые 30 мин после введения подавлялась практически полностью.

Таким образом, 5-окса-6-кето-простагландин Е₁ при внутривенном болюсном введении обладал выраженным антиагре- гационным действием.

Для оценки стабильности антиагрегационного эффекта 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ сухие образцы данного вещества хранили при температуре +4^оС в стеклянных или пластиковых пробирках. Исходные растворы простаноида готовили путем добавления к навеске 96^о-го этилового спирта (0,1 мл на 5 мг), затем эквимолярного количества гидрокарбоната натрия и физиологического раствора до получения раствора простаноида концентрацией 1 мг/мл. Исходные растворы хранили в стеклянных флаконах с притертыми пробками при температуре +4^оС. Рабочие растворы готовили уже непосредственно перед экспериментом из исходных, добавляя физиологический раствор в количествах, необходимых для получения нужной концентрации простаноида. Антиагрегационную активность 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ оценивали по его способности блокировать агрегацию тромбоцитов здоровых доноров в присутствии АДФ (10^-5 М).

Для изучения стабильности антиагрегационных свойств 5-окса-6-кето-простагландина Е₁, сохраняемого в сухом виде, из одного и того же образца данного вещества один раз в шесть месяцев на протяжении двух лет брали навески и разводили их по вышеописанной методике, после чего изучали влияние полученных растворов на функциональную активность тромбоцитов. Результаты опыта показали, что образец 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ за два года хранения в сухом виде не потерял своей антиагрегационной активности.

Стабильность образцов, хранящихся в виде растворов, оценивалась ежемесячно в течение двух лет. Полученные данные свидетельствуют о том, что хотя активность растворов 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ и снижалась с течением времени, однако даже через 24 месяца после разведения данный агент достоверно подавлял агрегацию тромбоцитов в концентрации 1 мкг/мл, что свидетельствует о его высокой стабильности при хранении.

Антиагрегационная активность 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ может быть также использована для стабилизации обогащенной тромбоцитами плазмы, так как известно, что многие средства, обладающие антиагрегационным эффектом и не повреждающие при этом ферментные системы, обеспечивающие функциональную активность клетки, способны сохранять полноценные тромбоциты в состоянии, пригодном для их последующей трансфузии. Для подтверждения данного свойства простаноида было изучено его влияние на функциональную активность тромбоцитов человека при хранении. Для проведения эксперимента богатую тромбоцитами плазму человека помещали в равных объемах в две стеклянные пробирки, причем одна из порций служила контролем, а к другой добавляли раствор 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ в количестве 1 мкг вещества на 1 мл богатой плазмы. Затем исследуемые пробы помещали на водяную баню при +37^оС на 4 ч, после чего их хранили при +4^оС в течение всего времени эксперимента. Функциональную активность тромбоцитов оценивали по их способности агрегировать в ответ на добавление АДФ (10^-5 М) в комплексе с адреналином (5 мкг/мл). Результаты исследования, представленные в табл.6, обработаны статистически с использованием метода для оценки зависимых выборов.

Полученные данные показывают, что при хранении образцов плазмы свыше 72 ч, присутствие в смеси 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ достоверно повышало функциональную активность тромбоцитов. Это свидетельствует о том, что данное вещество увеличивало продолжительность хранения тромбоцитов.

Изобретение относится к медицине и может найти применение для купирования состояний, сопровождающихся повышением адгезивно - агрегационной функции тромбоцитов и для консервирования обогащенной тромбоцитами плазмы. Предлагаемое средство, обладающее антиагрегационной активностью E₁ характеризуется возможностью применения при болюсном введении, высокой стабильностью при хранении, низкой способностью к биотрансформации в организме. 6 табл.

Применение 5-окса-6-кето-простагландина Е₁ в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью.