СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАГЕННОСТИ РАСТВОРОВ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к методам биологического тестирования качества воды и может быть использовано в промышленности, сельском хозяйстве, а также при режимном и санитарном контроле качества воды. Оценка мутагенной активности природных и сточных вод в последнее время становится особенно актуальной в связи с проведением программ экологического мониторинга окружающей среды.

Известен способ определения мутагенности воды с использованием дафний, в котором учитывается инициирование во втором поколении морфологических летальных и сублетальных мутаций, определяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, по уменьшению плодовитости и продолжительности жизни. Длительность эксперимента составляет 16-22 дн и более.

Однако этот метод трудоемок и не может быть использован в экспресс-контроле природных вод.

Известен способ выявления мутагенных факторов при действии на клетки дрожжей-сахаромицетов.

Однако оценка результатов возможна только на 5-6 сут, поэтому этот способ также не может быть использован в экспресс-диагностике качества вод.

Известен способ определения внешнесредовых мутагенных воздействий, который предусматривает учет сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах периферической крови человека.

Однако и этот способ трудоемок, оценка результатов возможна не ранее чем на 3-4 сут, а также недостаточно точен, так как мутационные изменения не всегда ассоциированы с возникновением сестринских хроматидных обменов и данным способом могут быть определены только S-зависимые мутагены.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения мутагенности растворов загрязняющих веществ и сточных вод с использованием в качестве биотеста культуры клеток китайского хомячка, основанный на оценке возникающих под действием исследуемого вещества в G₁-стадии клеточного цикла структурных мутаций хромосом.

Согласно прототипу клетки предварительно культивируют во флаконах Карреля в среде Игла с 20%-ной сывороткой крупного рогатого скота и антибиотиков в течение 3-4 сут при 37^оС до образования монослоя на дне флаконов. Затем ростовую среду удаляют и вносят растворы исследуемых веществ, приготовленные на среде Игла с 20%-ной сывороткой крупного рогатого скота и антибиотиков. Экспонируют флаконы при оптимальной для жизнедеятельности клеток температуре в течение 48 ч. Затем из флаконов удаляют среду с мутагеном и вносят раствор колхицина, приготовленный на среде Игла для остановки клеточного деления на стадии метафазы. Обработку колхицином ведут в течение 2 ч при оптимальной для жизнедеятельности клеток температуре. Затем раствор колхицина заменяют гипотоническим раствором хлорида калия для получения хорошо видимых хромосом. Результат тестирования оценивают визуально по разнице количества хромосомных аберраций, возникающих в клетках тест-объекта под действием мутагена, и количества хромосомных аберраций, возникающих в контрольных образцах.

Недостатками способа-прототипа являются низкая точность, которая определяется более низкой чувствительностью хромосом на стадии G₁ клеточного цикла к мутагенам химической природы и мешающим влиянием среды Игла с антибиотиками, в которой происходит взаимодействие тест-объекта с исследуемым веществом, что затрудняет биотестирование природных вод этим способом, а также значительная продолжительность (так как время проведения эксперимента 48-50 ч), что лишает способ экспрессности.

Целью изобретения является повышение точности и снижение времени определения мутагенности растворов. Для этого в способе определения мутагенности растворов предусматривается внесение биологического тест-объекта культуры клеток животного происхождения, в опытные и контрольные среды на субстрат, последующая инкубация их, определение количества хромосомных аберраций в клетках тест-объекта и определение мутагенности опытной среды по разнице между контрольным и индуцированным уровнями хромосомных аберраций, причем инкубацию тест-объекта в опыте проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, а период инкубации выбирают в пределах от 2 до 3 ч (воздействие мутагеном осуществляют в постсинтетической стадии митотического цикла), после чего в первом митозе проводят учет хромосомных аберраций.

При проведении биотестирования согласно изобретению для создания условий, близких по своим осмотическим свойствам к физиологическому раствору необходимых для поддерживания жизнедеятельности клеток, монослой клеток обрабатывают нестерильной природной водой с добавлением хлористого натрия. Таким образом достигается непосредственное взаимодействие тест-объекта с испытуемым веществом и исключается мешающее влияние питательных сред и антибиотиков, что повышает точность способа. Двух-трехчасовая экспозиция тест-объекта в среде мутагенов определяется продолжительностью G₂-стадии клеточного цикла, которая для клеток китайского хомячка составляет 2-4 ч. Изучение хромосомных аберраций на постсинтетической стадии клеточного цикла G₂ существенно повышает чувствительность способа, так как эта стадия является наиболее чувствительной к мутагенам среды.

Тестирование образцов природных вод предлагаемым способом становится возможным благодаря принципиальному изменению среды, в которой происходит взаимодействие тест-объекта с исследуемым раствором. Т.е. систему питательная среда + антибиотик + мутаген заменяют на систему: раствор хлорида натрия + мутаген. Таким образом, по сравнению с прототипом устраняется вероятность реагирования компонентов питательной среды с веществами, находящимися в природной воде, и не блокируется большим количеством антибиотиков биологический канал воздействия природной воды на монослой клеток, что является существенным в оценке качества природных вод.

Сравнение предлагаемого технического решения с прототипом и аналогами позволило установить отсутствие известных решений, содержащих ту же совокупность существенных признаков, позволяющую получить положительный эффект. При изучении других известных технических решений в области биотестирования признаки, отличающие предлагаемое изобретение от прототипа, не были обнаружены, что свидетельствует о существенности отличий.

Работа по предлагаемому способу осуществляется следующим образом.

Тестирование выполняют, например, на перевиваемой культуре фибробластов китайского хомячка субклона анеуплоидных клеток штамма 237 линии BLLdii FAF-28. Кариотип линии характеризуется наличием 5 хромосом с большими гетерохроматиновыми участками (2 половые и 3 маркерные). Культуру клеток китайского хомячка выращивают предварительно на среде Игла с добавлением глутаминовой кислоты, 20%-ной сыворотки крупного рогатого скота и пенициллина в количестве 100 ед. на 1 мл культуры. Концентрация клеток в культуре при ее приготовлении составляет 1 млн. в 10 мл. Культуру выращивают во флаконах Карреля в течение 26 ч при 37^оС. После того как на дне флакона сформируется монослой клеток, ростовую среду удаляют и заливают исследуемую нативную воду, доведенную по осмотическим параметрам до физиологического раствора, для чего предварительно к 9,65 мл воды добавляют 0,35 мл 0,4 М раствора хлорида натрия. Для контроля в другой флакон с монослоем тех же клеток на дне заливают физиологический раствор, приготовленный на дистиллированной воде (растворением 0,35 мл 0,4 М раствора хлорида натрия в 9,65 мл дистиллята). Наличие контроля необходимо, так как количественная оценка цитогенетических эффектов мутагенов невозможна без знания спонтанного уровня хромосомных аберраций у объекта, на котором проводятся исследования. Спонтанный уровень мутирования является своего рода естественным порогом, позволяющим определять минимальную дозу мутагена, вызывающую достоверное повышение индуцированных структурных мутаций над их спонтанным уровнем. Флаконы с исследуемыми и контрольными пробами помещают в термостат на 2 ч (что соответствует G₂ стадии клеточного цикла) при 37^оС. Затем исследуемую воду из флаконов удаляют и вносят среду культивирования и колхицын в концентрации 0,5 мкг на 1 мл (для накопления митозов стадии G₂). Флаконы помещают в термостат и инкубируют 2 ч при 37^оС. Затем содержимое из флаконов удаляют, вносят 10 мл гипотонического раствора хлористого калия 0,075 М и помещают в термостат на 20 мин. После этого флаконы встряхивают и содержимое переносят в пробирки, после чего центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, удаляют гипотонический раствор и к осадку приливают охлажденный фиксатор (абсолютный этиловый спирт и ледяная уксусная кислота 3: 1). Продолжительность фиксации 15 мин в холодильнике. Затем клетки ресуспендируют в фиксаторе и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 6 мин, после чего фиксатор удаляют, заменяют новым и повторяют те же процедуры. После последнего центрифугирования в пробирке оставляют 0,5-0,7 мл фиксатора и тщательно ресуспендируют клетки. Полученную суспензию клеток капают пипеткой на холодные влажные предметные стекла. Препараты высушивают на воздухе без подогрева. Окрашивание препаратов проводят азур-эозином. Растворы азура-П и эозин-натрия с концентрацией 0,1% готовят отдельно на 0,05 М фосфатном буфере при рН 6,8. Перед окраской препаратов краситель готовят следующим образом: к 15 мл фосфатного буфера (0,05 М, рН 6,8) добавляют 1 мл зозина и 2,5 мл азура-П, продолжительность окpашивания 4-6 мин, после чего препараты промывают проточной водой и высушивают. Учет хромосомных аберраций проводят при помощи микроскопа в иммерсионной системе при увеличении 10 х 90. Анализируют не менее 100 метафаз. Результаты опытных образцов сравнивают с контрольными. О мутагенности исследуемой жидкости судят по статически достоверным отличиям хромосомных аберраций в опыте и контроле.

Результаты опыта по данному примеру с использованием в качестве тест-объекта культуры клеток китайского хомячка штамма 237 представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, предлагаемый способ позволяет учитывать не только количественно хромосомные аберрации, но и качественно. В то же время по результатам эксперимента можно сделать вывод о мутагенности исследуемых образцов воды в сравнении с контролем.

В табл. 2 представлены результаты биотестирования природной воды на мутагенность, полученные предлагаемым способом и по прототипу. В качестве тест-объекта в обоих случаях используют монослой клеток соединительной ткани фибробластов китайского хомячка субклона анеуплоидных клеток штамма 237 линии BLLdii FAF-28, сформированный на дне флакона Карреля. Исследуемые пробы воды имеют разный уровень эффективной концентрации токсичных загрязняющих веществ. В опыте, выполненном способом-прототипом, время экспозиции монослоя с исследуемыми образцами воды 48 ч. Разведение природной воды готовят на среде Игла в соотношении 1:10, т.е. 1 мл исследуемой жидкости и 10 мл среды Игла. В опытах предлагаемым способом разведение в природной воде готовят на стандартном физиологическом растворе. При этом сначала доводят осмотические показатели природной воды до показателей физиологического раствора, для чего к 9,65 мл природной воды добавляют 0,35 мл 0,4 М раствора хлорида натрия, а затем 1 мл приготовленного раствора тестируемой воды растворяют в 10 мл стандартного физиологического раствора. Время экспозиции тест-объекта в исследуемой воде 2 ч. В качестве контроля в обоих случаях используют физиологический раствор. После 2-часовой экспозиции растворы из флаконов сливают и вносят во флаконы по 10 мл среды Игла и 0,02 мл 0,05 М раствора колхицина для сбора митотических клеток на стадии метафазы. Выдерживают флакон в термостате при 37^оС в течение 2 ч. Затем содержимое из флаконов удаляют и вносят гипотонический 0,075 М раствор хлорида калия. Флаконы выдерживают в термостате 20 мин при 37^оС. Фиксацию клеток ледяной уксусной кислотой и этиловым спиртом (1:3) производят через 28 ч от начала культивирования, что соответствует первому митозу клеток китайского хомячка в культуре. Каждый опыт проводят в 2-3 повторностях и на одну экспериментальную точку анализируют 100 метафаз.

Как следует из табл. 2, с увеличением эффективной концентрации токсичных и загрязняющих веществ растет доля хромосомных аберраций клеток. Причем предлагаемый способ более точен, так как он дает возможность улавливать незначительные изменения концентраций токсичных и загрязняющих веществ в исследуемых жидкостях. Так в опыте 1 способом, выполненным по прототипу, зарегистрировано 7 хромосомных аббераций на 100 клеток, а предлагаемым способом 21. В опыте 2, несмотря на уменьшение токсичных и загрязняющих веществ, зарегистрировано 7 хромосомных аберраций на 100 клеток при выполнении эксперимента по способу-прототипу. При выполнении эксперимента предлагаемым способом зарегистрировано 17 хромосомных аберраций на 100 клеток.

Таким образом, предлагаемый способ более точен и обладает экспрессностью по сравнению со способом-прототипом (точность выше в 2-3 раза, а время, необходимое для проведения эксперимента предлагаемым способом, в 24 раза меньше, чем по прототипу). Таким образом, изобретение обеспечивает по сравнению с прототипом более точный и быстрый биоконтроль на мутагенность растворов и природных вод.

Использование: биологическое тестирование растворов, режимный и санитарный контроль качества воды. Сущность: культуру клеток животного происхождения вносят в опытные и контрольные среды на субстрат, инкубируют их в течение 2 - 3 ч и определяют количество хромосомных аберраций в клетках тест-объекта. Инкубацию тест-объекта в опыте проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, а период инкубации выбирают в пределах от 2 до 3 ч. 2 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАГЕННОСТИ РАСТВОРОВ, предусматривающий внесение биологического тест-объекта культуры клеток животного происхождения в опытные и контрольные растворы на субстрат, последующую инкубацию их, определение количества хромосомных аберраций в клетках тест-объекта и установленные опытной среды мутагенной при достоверной разнице числа хромосомных аберраций в опыте по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения сроков определения, инкубацию тест-объекта в опыте и контроле проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, в течение 2 3 ч в постсинтетической стадии митотического цикла.