Способ определения токсичности водной среды Советский патент 1992 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к методам биологического тестирования качества воды и может быть использовано в промышленности, сельском хозяйстве, а также при режимном и санитарном контроле качества воды.

Известен способ определения токсичности и мутагенности воды с использованием дафний, в котором учитывается инициирование во Епчэром поколении морфологических летальных и сублетальных мутаций, определяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, по уменьшению плодовитости и продолжительности жизни. Длительность эксперимента составляет 16-22 дня и более. Этот метод трудоемок и не может быть использован в экспресс-контроле природных вод.

В способе о токсичности испытуемой жидкости судят по изменению способности клеток подвижной земной водоросли

Dunaliella salina возвращать первоначальную эллипсоидную форму в дистиллированной воде после обработки токсикантом. Сравнение контрольных образцов, где восстановление исходной формы происходит за 12 - 15 мин, и опытных, где восстановления не происходит, позволяет сделать вывод о токсичности среды. Способ достаточно прост технически, однако трудоемок, так как на обработку одной пробы уходит 40 мин и более.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения токсичности растворов загрязняющих веществ и сточных вод с использованием в качестве биотеста культуры клеток рыб, основанный на исследовании адгезивной способности клеток к поверхности субстрата в стационарной фазе роста монослоя клеток фолликулярного эпителия (гонад бычка-кругляка) или оспенч

00 О О

о

ых разростков на коже карпа под действи; м растворов загрязняющих веществ и сточых вод.

Согласно прототипу предварительно летки культивируют во флаконах со средой 199 с добавлением 20% сыворотки крупного огатого скота и антибиотиков: 100 ЕД/мл енициллина и 100 мг/мл стрептомицина в ечение 2-5 сут в зависимости от вида инии клеток до образования монослоя на не флакона. Затем ростовую среду удаляют и вносят растворы исследуемых веществ, приготовленные на среде 199 с добавлением антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина) для предотвращения бактериального загрязнения. Экспонируют флаконы при оптимальной для жизнедеятельности клеток температуре 24 - 96 ч. Результат оценивают визуально по цитотоксическому эффекту, проявляющемуся в откреплении части клеток монослоя от р,иа флакона, Определяют сохранность монослоя культуры клеток, подсчитывая число оставшихся на субстрате клеток с помощью камеры Горяева, и выражают его в относительных единицах, по величине доли которых судят о токсичности исследуемого раствора.

Недостатками способа-прототипа являются низкая чувствительность (определяется низкой чувствительностью тест-объекта и мешающим влиянием среды 199 с антибиотиками, в которой происходит взаимодействие тест-обьекта с исследуемым веществом), что затрудняет биотестирование природных вод, а также низкая производительность (так как время проведения эксперимента 24 - 96 ч), что лишает способ экспрессности.

Целью изобретения является повышение точности и снижение времени определения.

Для достижения цели в способе определения токсичности водной среды, предусматривающем внесение биологического тест-обьекта - культуры клеток животного происхождения, находящихся в стационарной фазе роста, в опытные и контрольные среды на субстрат, последующую инкубацию их, определение количества клеток в опытных и контрольных средах на субстрате и определение токсичности опытной среды в случае снижения количества клеток в ней по сравнению с контрольной, в качестве тест-объекта используют культуру клеток соединительной ткани животных, инкубацию тест-объекта в опыте проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, а период инкубации равен 1,5 - 2,5 ч.

Работа по предлагаемому способу осуществляется следующим образом.

Тестирование выполняют, например, на перевиваемой культуре фибробластов китайского хомячка линии V-79, или субклона анеуплоидных клеток штамма 237 линии Blldii FAF 28, подкожной соединительной ткани,или фибробластоподобных клеток лимфомы мыши линии L-929.

0 Сначала выращивают клетки в специальных флаконах Карреля в ростовой среде Игла, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота и 10 ЕД/мл пенициллина (для предупреждения бактериального загрязне5 ния).

После того, как на дне флакона Карреля сформировался монослой клеток соединительной ткани в стационарной фазе роста, ростовую среду из флакона удаляют и зали0 вают исследуемую нативную воду, доведенную по осмотическим параметрам до физиологического раствора, для чего предварительно к 9,65 мл воды добавляют 0,36 мл 0,4 М раствора хлорида натрия. Для кон5 троля в другой флакон с моноспоем тех же клеток на дне заливают физиологический раствор, приготовленный на дистиллированной воде растворением 0,35 мл 0,4 М раствора хлорида натрия в 9,65 мл дистил0 лята.

Наличие контроля необходимо для оценки состояния культуры клеток и возможности использования ее в качестве тест- объекта, а также для сравнения поведения

5 монослоя клеток в условиях стандартного физиологического раствора и в условиях исследуемых природных вод, осмотические свойства которых доведены до параметров физиологического раствора.

0 Флаконы с исследуемыми и контрольными пробами помещают в термостат.

Из таблицы видно, что экспозиция проб от 1,5 до 2,5 ч наиболее оптимальна. В исследуемых пробах под действием токсичных

5 веществ происходит атрофия части клеток, ведущая к изменению функции их прикрепления и распластывания на твердом субстрате. В результате происходит округление части клеток и переход их в раствор. По

0 завершении двухчасовой инкубации раствор из флаконов переносят в пробирки и при помощи камеры Горяева определяют количество Xi открепившихся клеток в каждой из них.

5 Оставшийся на дне флакона монослой заливают 10 мл трипсина. Флакон встряхивают и переносят взвесь клеток в пробирку. Подсчет оставшихся на стекле клеток Ха, перешедших в раствор трипсина, ведут по той же методике.

Находят общее количество клеток, участвовавших в биотестировании:

X Xi + Х2

Вычисляют процент А оставшихся на стекле клеток.

. Х2 10° А ,

где А - процент оставшихся на стекле клеток;

Х2 - оставшиеся на стекле клетки;

X - общее количество клеток в монослое.

Найденная величина характеризует адгезивную способность клеток монослоя к поверхности стекла.

Результаты опыта сравнивают с контрольными пробами, где адгезивная способность клеток к субстрату после двухчасовой экспозиции монослоя в физиологическом растворе не изменяется, а доля оставшихся на стекле клеток составляет 100%.

Высокая чувствительность тест-объекта (соединительной ткани) позволяет выделить уровни токсичности исследуемых растворов, которые определяют по степени ответа тест-объекта на воздействие исследуемой среды. Оценочная шкала приведена ниже.

Результаты трех параллельных опытов по данному способу с использованием в качестве тест-объекта культур клеток соединительной ткани; фибробластов китайского хомячка линии V-79, клона 237 и клеток лим- фомы мыши линии L-929 представлены в табл.3.

Для эксперимента брали пробы воды с известным уровнем токсических веществ (пирокатехина и паробензохинона).

Приведенные в табл.3 данные по определению токсичности природных вод показывают, что доля оставшихся на субстрате клеток (%) и соответственно уровень токсичности коррелирует с количеством токсических веществ, определенных методом химического анализа. Корреляция между уровнем токсичности образцов природных вод и концентраций токсических веществ, как показано в табл.2, зарегистрирована для всех трех типов клеток соединительной ткани. Монослой всех трех типов клеток реагирует одинаково на наличие токсиканта в определенной концентрации.

В табл.4 представлены результаты биотестирования воды на токсичность, полученные предлагаемым способом и по способу-прототипу.

Исследуемые пробы воды имели известный уровень токсических веществ (пирокатехина - опыт 1 и парабензохинона - опыт 2). В опытах, выполненных способом-прототипом, в качестве тест-объекта использовали культуру яйцеклеток бычка кругляка (ЯБК), время экспозиции монослоя с исследуемыми образцами воды 72 ч. Разведение

природной воды готовили на среде 199 в соотношении 1:10 - 1 мл исследуемой жидкости: 10 мл среды 199.

В опытах предлагаемым способом в качестве тест-объекта использовали монослой

0 культуры фибробластов китайского хомячка линии V-79. Разведение природной воды готовили на стандартном физиологическом растворе. При этом сначала доводили осмотические показатели природной воды до по5 казателей физиологического раствора. Для этого к 9,65 мл природной воды добавляли 0,35 мл 0,4 М р-ра хлорида натрия. Затем 1 мл приготовленного раствора тестируемой воды растворяли в 10 мл стандартного фи0 зиологического раствора. Время экспозиции тест-объекта в исследуемой воде 2 ч. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Учет результатов проводили описанным способом, долю ос5 тавшихся на стекле клеток выражали в %.

Как следует из данных табл.4, с увеличением концентрации токсических веществ падает доля оставшихся на стекле клеток. Предлагаемый способ более чувствителен,

0 так как он дает возможность улавливать незначительные концентрации токсических веществ в исследуемых жидкостях. Так, в опыте 1, выполненном по прототипу, зарегистрирована высокая токсичность (46% ос5 тавшихся на стекле клеток), а предлагаемым способом - очень высокая (11 % оставшихся на стекле клеток); в опыте 2 - средняя (66% оставшихся на стекле клеток) и очень высокая (12% оставшихся на стенке клеток)соот0 ветственно.

В табл.5 представлены результаты определения токсичности природной воды предлагаемым способом и контрольного определения токсичности воды с использовз5 нием в качестве тест-объекта рачка дафния магна,

Дафнии используются в кратковременных (2-4 сут) опытах для установления острой токсичности сточных вод и отдель0 ных веществ по длительности выживания рачков. Контролем служит выживаемость рачков в чистой воде.

В каждый опытный стакйн наливают200 мл исследуемой жидкости. Из кристаллиза5 тора пипеткой отбирают 10 экземпляров дафний в возрасте 2-4 сут и переносят в исследуемый раствор. В первые 8 ч ежечасно, а затем один -два раза в день учитывают количество живых особей, степень и характер их передвижения, количество сброшенных панцирей. Погибших дафний удаляют пипеткой. Раствор раз в сутки обновляют ввиду продолжения биохимического окисления и детоксикации. По результатам опытов определяют среднее время выживания 50% особей. Изменения жизнедеятельности дафний в опытах сравнивают с контролем. Если 50% дафний гибнут за 24 - 48 ч, считают, что среда обладает очень сильной токсичностью, если за 4 сут, то среда харак- теризуэтся как сильно токсичная. Если за период наблюдений гибели дафний не происходит, то исследуемая жидкость острой токсичностью не обладает.

Таким образом, результаты контрольного биотестирования природной воды на рачках дафния магна подтверждают вывод об уровне токсичности исследуемых образцов нативной воды с использованием в качестве тест-объекта монослоя культур клеток китайского хомячка.

Предлагаемый способ более чувствителен и обладает экспрессностью по сравнению со способом-прототипом (чувствительность выше в 2 - 4 раза, а время, необходимое для проведения эксперимента, в предлагаемом способе в 36 раз меньше, чем по прототипу). Таким образом, изобретение обеспечивает по сравнению с прототипом более точный и быстрый биоконтроль качества природных вод. Формула изобретения Способ определения токсичности водной среды, предусматривающий внесение биологического тест-объекта - культуры клеток животного происхождения, находящихся в стационарной фазе роста, в опытные и контрольные среды на субстрат, последующую инкубацию их, определение количества клеток в опытных и контрольных средах

на субстрате и определение токсичности опытной среды в случае снижения количества клеток в ней по сравнению с контрольной, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и снижения времени

определения, в качестве тест-объекта используют культуру клеток соединительной ткани животных, инкубацию тест-объекта в опыте проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, а

период инкубации выбирают в пределах от 1,5 до 2,5 ч.

Таблица 1

Применение: определение токсичности водной среды. Сущность: культуру клеток соединительной ткани животных, находящихся в стационарной фазе роста, инкубируют в течение 1,5 - 2,5 ч в опытных и контрольных средах на субстрате. Критерием токсичности считают снижение количест- ва клеток в опыте по сравнению с контролем. 5 табл. с/

Зависимость адгезивной способности клеток к поверхности субстрата (стекла) от времени экспозиции

Таблица 2

Оценочная шкала токсичности растворов в зависимости от доли оставшихся на субстрате клеток монослоя соединительной ткачи после воздействия растворов разного

качества

Токсичность

Не токсична Слабая токсичность Средняя токсичность Высокая токсичность Очень высокая токсичность

оставшихся на стекле клеток ( в %J

100-95 94-80 79-50 49-20 Менее 20

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5