АНТИМУТАГЕН Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 

Область техники

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к отысканию новых и эффективных средств с антимутагенной активностью.

Уровень техники

В широком смысле антимутагены - это химические, физические и биологические факторы, снижающие частоту мутаций и защищающие тем самым геном. Активный поиск химических антимутагенов ведется по двум направлениям: изучения синтетических химических соединений на предмет наличия антимутагенных свойств [1] и исследования на сей предмет продуктов природного происхождения.

Одним из последних примеров таких исследований является обнаружение антимутантных свойств у кожицы ягод винограда, точнее у содержащегося в ней антоциал-антоцианового (красного) красителя. Сотрудники Всероссийского научно-исследовательского института пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности установили, что если в пищу добавлять этот краситель, то можно существенно снизить мутагенное воздействие таких веществ как циклофосфамид и диоксидин, которые вызывают хромосомные повреждения в клетках костного мозга [2].

Новым полем исследования природных продуктов является анализ на наличие антимутагенных свойств пищевых добавок растительного происхождения (БАДов) [3-7]. Предпосылкой таких исследований является наличие у многих БАДов таких свойств, как противовоспалительное, седативное, общеукрепляющее, при одновременном отсутствии нежелательных побочных эффектов при применении.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является отыскание нового перспективного антимутагена природного происхождения.

Авторы изобретения обнаружили, что антимутагенными свойствами обладает экстракт бересты (белой части коры березы).

Авторы предполагают, что носителем антимутагенной активности указанного экстракта является бетулин, содержащийся в бересте. Антимутагенная активность была обнаружена у экстракта бересты с содержанием бетулина более 70%.

Будучи известным еще с конца 18 века, бетулин является в последнее время веществом, привлекающим широкое внимание исследователей. В литературе на сегодняшний день описаны свыше 20 видов биологической активности бетулина, среди которых такие как антиоксидантная, противовирусная, цитотоксическая, иммуномодулирующая, антипролиферативная, гепатопротективная [8]. Однако на наличие у бетулина антимутагенных свойств в литературе указаний нет.

Раскрытие изобретения.

Исследование проводилось с использованием в качестве препарата суспензии сухого экстракта бересты, полученного от ООО «Березовый мир», г. Москва, с содержанием бетулина, определенным посредством ВЭЖХ, 72%.

Для оценки антимутагенных свойств экстракта бересты использовали метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, рекомендованный для подобного рода исследований [1]. Метод основан на визуальной регистрации хромосомных повреждений в клетках костного мозга мелких лабораторных грызунов.

Схема эксперимента предусматривала

- три режима обработки животных, моделирующих возможные варианты его практического применения,

- использование экстракта в трех дозах для регистрации возможной зависимости "доза-эффект",

- применение заведомых мутагенов в дозах, в которых они проявляют выраженный цитогенетический эффект в клетках костного мозга использованных животных.

Исследование выполнено на самцах мышей линии C₅₇BL/6 массой 18-20 г. Животных содержали при 12-часовом световом режиме, на стандартном брикетированном корме, при свободном доступе к воде.

Экстракт бересты (далее БЭ) вводили перорально в водной суспензии твина-80 в дозах 50, 150 и 450 мг/кг. Мутагены: циклофосфамид из расчета 20 мг/кг и диоксидин в дозе 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде водных растворов. Применяли три режима обработки животных: однократное совместное введение БЭ с мутагеном, предварительное пятидневное введение БЭ, предусматривающее его сочетанное применение с мутагеном в последний день обработки животных, а также ежедневное совместное 5-дневное введение БЭ с мутагеном.

Цитогенетические препараты готовили через 24 часа после однократного или, в случае повторных введений, последнего введения препарата.

Во всех вариантах экспериментов животным за 2,5 часа до забоя вводили колхицин (Serva, Германия) из расчета 2,5 мг/кг с целью подавления формирования ахроматинового веретена клеточного деления и накопления метафаз.

Забой животных осуществляли смещением шейных позвонков. Максимально быстро выделяли бедренные кости, срезали эпифизы и вымывали клетки костного мозга гипотоническим раствором (0.55% KCl), предварительно подогретым до 37°С. После инкубации при 37°С в течение 15 минут клеточную взвесь центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин (центрифуга ОПН-3, Россия). Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспензировали и добавляли 3 мл предварительно охлажденного фиксатора, состоящего из смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Время инкубации клеток в фиксаторе составляло 10 минут. Затем проводили повторное центрифугирование и смену фиксатора (3 мл). После этого клетки инкубировали в холодильнике 20 минут. Взвесь вновь центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 0.5 мл вновь добавленного фиксатора и наносили на мокрые предварительно обезжиренные и охлажденные стекла, которые высушивали в пламени спиртовой горелки.

Окраску производили азур-эозином. Состав красителя включал: 5 частей азура (0.1%), 2 части эозина (0.1%), 10 частей дистиллированной воды. При цито-генетическом анализе использовали микроскоп Zeiss Standart-20, 10 X 100.

При цитогенетическом анализе учитывали клетки с ахроматическими пробелами (генами), одиночными и парными фрагментами хромосом, хромосомными и мосом (более 5 хромосомных повреждений в клетке). Оценку антимутагенной активности производили путем сравнения суммарного количества клеток с гепами и структурными повреждениями хромосом в контрольных (позитивный контроль с мутагенами) и хроматидными обменами, а также клетки с множественными повреждениями хромосом опытных сериях (комбинации бетулина с мутагенами) исследования. На каждое животное анализировали по 100 метафаз, в каждой группе было исследовано 5 животных. Статистический анализ проводили с помощью ϕ-критерия.

Результаты цитогенетического исследования, посвященного оценки влияния бетулина на цитогенетические эффекты примененных химических мутагенов, представлены в таблицах 1-3.

В таблице 1 приведены результаты, характеризующие влияние БЭ на цитогенетические эффекты диоксидина и циклофосфамида, применяемых из расчета 200 и 20 мг/кг соответственно.

Однократное введение диоксидина в дозе 200 мг/кг привело к увеличению числа клеток с хромосомньми аберрациями до значения 10.2±1.4%, что статистически достоверно выше контрольных значений (1.6±0.6%), регистрируемых у животных, получавших физиологический раствор.

После введения комбинации БЭ в дозе 50 мг/кг и диоксидина из расчета 200 мг/кг зафиксировано 4.8±1.0% аберрантных метафаз. Полученное значение статистически достоверно отличается от значения позитивного контроля и соответствует 53% снижению цитогенетического эффекта диоксидина. Применение БЭ в дозе 150 мг/кг привело к возрастанию антимутагенного эффекта до 61%, было зарегистрировано всего 4.0±0.9% поврежденных метафаз. БЭ в максимальной из использованных дозе 450 мг/кг также обладал значимым антимутагенным эффектом. Однако в количественном отношении эффект был выражен слабее и составил только 33%.

Антимутагенные эффекты БЭ были далее подтверждены при использовании в качестве модельного мутагена циклофосфамида (таблица 1).

В таблице 1 представлены результаты экспериментов по влиянию однократного введения БЭ на цитогенетические эффекты этого мутагена. При применении БЭ в дозах 50 и 150 мг/кг зарегистрирован одинаковый антимутагенный эффект: снижение повреждающего действия мутагена в обоих случаях составило 60% (уровень хромосомных аберраций 3.5±0.9% против 8.8±1.4% в позитивном контроле). В максимальной дозе, равной 450 мг/кг, БЭ не проявил антимутагенной активности: полученный показатель - 6.4±1.1% аберрантных метафаз, не отличался достоверно от значения позитивного контроля.

В следующей серии экспериментов, результаты которых представлены в таблице 2, исследовалось влияние 5-дневной предобработки БЭ на проявление цитогенетических эффектов диоксидина.

Обращает внимание, что при данном режиме введения антимутагенные эффекты БЭ существенно возросли в сравнении с аналогичными, отмеченными при его однократном введении.

БЭ в дозе 50 мг/кг вызывал 49% снижение повреждающего действия мутагена. С увеличением вводимой дозы до 150 мг/кг защитный эффект БЭ возрос и составил 63%. При применении в дозе 450 мг/кг препарат продемонстрировал максимальный антимутагенный эффект - полное подавление повреждающего действия мутагена: полученный показатель - 2.6±0.7% аберрантных метафаз, не отличается статистически от значения, характеризующего спонтанный уровень мутирования (1.6±0.6%).

Антимутагенные эффекты БЭ при его использовании в режиме 5-дневной предобработке возросли по сравнению с однократным введением и при использовании в качестве мутагена циклофосфамида (таблица 2).

После введения циклофосфамида животным, обработанным БЭ в дозе 50 мг/кг, зарегистрировано 5.5±1.1% аберрантных метафаз, что соответствует 54% снижению цитогенетических эффектов мутагена. С увеличением дозы до 150 мг/кг антимутагенный эффект БЭ возрос и составил 65%: 4.2±0.9% аберрантных метафаз против 12.0±1.5% в позитивном контроле. В отличие от экспериментов с однократным введением БЭ проявил антимутагенный эффект и в дозе 450 мг/кг. Полученный показатель, 4.4±0.9% поврежденных клеток, соответствовал 63% редукции цитогенетического эффекта мутагена.

В следующей серии экспериментов исследовали влияние БЭ на мутагенные эффекты диоксидина и циклофосфамида в условиях 5-дневного совместного введения. Полученные результаты представлены в таблице 3.

После пятидневной обработки животных диоксидином в дозе 200 мг/кг хромосомные аберрации зарегистрированы в 11.6±1.4% исследованных метафаз. После совместного применения БЭ в дозе 50 мг/кг и диоксидина выявлено только 6.6±1.2% поврежденных клеток, что соответствует 43% снижению цитогенетического действия мутагена. Результат, полученный после совместного применения мутагена и БЭ в дозах 150 и 450 мг/кг составил соответственно 4.8±1.1% и 5.8±1.0% аберрантных метафаз. Попарное сопоставление зарегистрированных результатов с данными позитивного контроля выявило статистически достоверные различия, при этом в случае использования БЭ в дозе 150 мг/кг антимутагенный эффект составил 59%, в дозе 450 мг/кг - 50%.

При использовании циклофосфамида антимутагенный эффект БЭ выявлен во всех исследованных дозах. После совместного введения БЭ в дозе 50 мг/кг и мутагена зарегистрировано 3.8±0.7% аберрантных метафаз, что соответствует 54% снижению цитогенетического эффекта циклофосфамида. При применении БЭ в более высоких дозах 150 и 450 мг/кг антимутагенные последнего оказались сходными. Полученные показатели 5.0±1.0 и 5.2±1.0% аберрантных метафаз соответствовали 40 и 38% редукции повреждающего действия мутагена.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии у БЭ антимутагенной активности. По совокупности полученных данных антимутагенные эффекты БЭ наиболее выражены в условиях предварительного многодневного введения и при его использовании в диапазоне доз 50-150 мг/кг. Сравнительный анализ антимутагенного действия по отношению к повреждающему действию двух использованных мутагенов показывает, что формально БЭ несколько более эффективен в случае применения в качестве модельного мутагена диоксидина. Однако это различие не имеет принципиального значения.

Промышленная применимость

Экстракт бересты в диапазоне доз 50-450 мг/кг обладает антимутагенной активностью, выражающейся в уменьшении цитогенетических эффектов заведомых мутагенов - циклофосфамида и диоксидина. Защитный антимутагенный эффект в большинстве случаев превышает 50%, что указывает на эффективность возможного использования бетулина и содержащего экстракт бересты в качестве фармакологического средства защиты генома.

Таблица 1. Влияние однократного введения БЭ на цитогенетические эффекты диоксидина или циклофосфамида в клетках костного мозга мышейУсловия ЭкспериментаКлетокна 100 клетокВсего поврежденных метафаз(%)Снижение ↓ или повышение ↑ эффекта мутагена (%)ргеповодиночных фрагментовПарных фрагментовобменовклеток сМП*Контроль5000.21.40001.6±0.6  Диоксидин 200 мг/кг50007.40.40.43.610.2±1.4  + БЭ 50 мг/кг50005.3000.84.8±1.0↓53<0.01150 мг/кг5000.25.80.301.34.0±0.9↓61<0.001450 мг/кг50005.2002.06.2±1.1↓33<0.05Циклофосфамид 20 мг/кг4000.210.01.30.31.08.8±1.4  + БЭ 50 мг/кг4000.63.00.3003.5±0.9↓60<0.01150 мг/кг4000.84.30003.5±0.9↓60<0.01450 мг/кг5000.211.00.2006.4±1.1->0.05* - клеток с множественными повреждениями хромосом

Таблица 2. Влияние 5-дневного предварительного введения БЭ на цитогенетические эфзфекты диоксидина или циклофосфамида в клетках костного мозга мышей.Условия экспериментаКлетокна 100 клетокВсего поврежденных метафаз (%)Снижение ↓ или повышение ↑ эффекта мутагена (%)Ргеноводиночных фрагментовпарных фрагментовобменовКлеток с МПКонтроль5000.21.40001.6±0.6  Диоксидин 200 Мг/кг5000.211.40.40.64.49.8±1.3  + БЭ 50 мг/кг4000.45.30.30.32.05.0±1.1↓49<0.01150 мг/кг5000.25.8000.43.6±0.8↓63<0.001450 мг/кг5000.24.6000.22.6±0.7↓73<0.001Циклофосфамид 20 мг/кг5000.615.00.61.01.612.0+1.5  + БЭ 50 мг/кг4000.46.20.2005.5±1.1↓54<0.001150 мг/кг50006.00.200.24.2±0.9↓65<0.001450 мг/кг50007.200.204.4±0.9↓63<0.001

Таблица 3. Влияние БЭ на цитогенетические эффекты диоксидина или циклофосфамида при 5-дневном совместном введении.Условия экспериментаКлетокна 100 клетокВсего поврежденных метафаз (%)Снижение ↓ или Повышение ↑ эффекта мутагена (%)Ргеноводиночных фрагментовпарных фрагментовобменовКлето
КС
МПКонтроль5000.21.40001.6±0.6  Диоксидин 200 мг/кг5000.28.20.205.011.6±1.4  + БЭ 50 мг/кг5000.410.400.20.66.6±1.2↓43<0.01150 мг/кг4000.85.30.300.34.8±1.1↓59<0.001450 мг/кг5000.26.80.201.05.8±1.0↓50<0.001Циклофосфам ид 20 мг/кг5000.88.20.21.02.68.4±1.2  + БЭ 50 мг/кг5000.45.40003.8±0.7↓54<0.01150 мг/кг5000.86.40.2005.0±1.0↓40<0.05450 мг/кг5000.66.400.20.65.2±1.0↓38<0.05

Источники информации

1. Бочков Н.П., Дурнев А.Д. и др. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами (Методические рекомендации). Химико-фармацевтический журнал, 1992, т.26, №9-10,стр.42-46.

2. Н.Резник. Виноградная защита.

http:www.inauka.ru/discovery/article3078.

3. Дурнев А.Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания. Генетика, 1997 г., №2, стр.165-176.

4. Даугель-Дауге И.О., Дурнев А.Д. и др. Корпускулярный мутагенез и его профилактика. Вестник РАМН, 1995 г., №1, стр. 29-37.

5. Порошенко Г.Г. Антимутагены: подходы к классификации и перспектива поиска активных соединений. Вестник РАМН, 1995 г., №1, стр.38-41.

6. Алекперов Р.У. Антимутагенная защита генетического аппарата человека в условиях острой интоксикации. Вестник РАМН, 1995 г., №1. стр.49-51.

7. Болтина И.В., Петрашенко Л.П. и др. Комплексное генетико-токсическое обследование лиц, принимавших БАД VAKORAI

http://medved.kiev.ua/arhiv mg/st 2002/02 4 15.htm/

8. Wellmax. Путеводитель.

http://wellmax.ru/guide/part 1.3.html/

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется как антимутагенное средство. Применение экстракта бересты с содержанием в нем бетулина более 70% в качестве антимутагена. Экстракт бересты с содержанием в ней более 70% бетулина обладает эффективным антимутагенным действием. 3 табл.

Применение экстракта бересты с содержанием в нем бетулина более 70% в качестве антимутагена.