СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ В ДЕИОНИЗИРОВАННОЙ ВОДЕ Российский патент 1995 года по МПК C12Q1/04 C12Q3/00 

Изобретение относится к микробиологическому контролю и может быть использовано в микроэлектронике, био- и медицинской технологии для контроля содержания бактерий в ультрачистой воде.

Для определения микроорганизмов в воде используют способ выращивания колоний бактерий на питательных средах с помощью мембранной фильтрации. Время инкубации не менее 24 ч при 37±0,5^оС.

Для выявления колоний микроорганизмов используют индикатор вещество, окрашивающее колонии бактерий.

Недостатком данного метода является низкая чувствительность питательной среды и вследствие этого длительность анализа.

Целью изобретения является сокращение времени определения количества микроорганизмов в деионизированной воде.

Принципиальным отличием данного метода является отказ от использования стандартных сред (типа РПА, МПА, ДПА) и импортных Millipore, Gelman, Sartorius, а также использование в качестве питательной среды раствора фосфатного буфера "Зеренсона" (рН=8,2). В качестве индикатора метилтиозолилтетразолий бромистый (МТТ). Температура инкубации 39-41^оС, длительность инкубации сокращается до 60-75 мин.

Олиготрофные бактерии, существующие в ультрачистой воде, довольствуются минимальным количеством питательных веществ для жизнедеятельности, причем питательными веществами для них могут служить не только органические вещества, но и неорганические, каковыми являются элементы калий, натрий, фосфор, входящие в состав буфера [1] Точный подбор рН и температурного режима инкубации обуславливает интенсивный рост микроорганизмов.

Индикатор метилтиозолилтетразолий бромистый (МТТ), легко проникая в живую клетку бактерии, взаимодействует с ферментом живой клетки С-оксидазой, при этом происходит восстановление бесцветной формы МТТ в формазан красного цвета [2-4]
При осуществлении способа определения количества микроорганизмов в деионизированной воде осуществляют отбор исследуемой пробы, фильтрацию ее через мембранный фильтр, введение последнего в питательную среду, содержащую индикатор, инкубирование микроорганизмов с последующим установлением их количества, в качестве питательной среды используют фосфатный буфер с рН=8,2, индикатор представляет собой водно-спиртовой раствор метилтиозолилтетразолия бромистого с концентрацией 0,15% при этом инкубирование микроорганизмов осуществляют при 39-41^оС в течение 60-75 мин.

П р и м е р конкретного осуществления способа. Приготовление 0,15%-ного раствора МТТ на фосфатном буфере "Зеренсона" (рН=8,2).

Реактивы готовят следующим образом:
1. Приготовление раствора "А".

9,09 г однозамещенного фосфата калия КН₂РО₄ растворяют в колбе на 1000 мл в дистиллированной воде и доводят до метки. Раствор должен соответствовать 1/15 М КН₂РО₄.

2. Приготовление раствора "Б".

11,88 г двузамещенного фосфата натрия Na₂HPO₄ ˙ H₂O растворяют в мерной колбе на 1000 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор соответствует 1/15 M Na₂HPO₄ ˙ 2H₂O.

3. Приготовление буферного раствора (рН=8,2).

В мерную колбу на 100 мл пипеткой отмеряют 3,3 мл раствора "А". Доводят до метки раствором "Б". Тщательно перемешивают.

4. Приготовление 0,15%-ного раствора МТТ.

0,15 г соли МТТ растворяют в 10 мл этилового спирта в мерной колбе на 100 мл. Доливают до метки раствором фосфатного буфера.

Способ осуществляют следующим образом.

250-500 мл испытуемой воды профильтровывают через мембранный фильтр. Фильтр переносят в стерильную чашку Петри, на дно которой помещают обеззоленный фильтр, смоченный 1,5-3,0 мл фосфатного буфера "Зеренсона" с растворенным в нем 0,15% МТТ.

Чашки Петри помещают в термостат при 39-41^оС. Через 60-75 мин окрашенные живые клетки микроорганизмов подсчитывают под микроскопом в проходящем свете.

Использование: микробиологический контроль, а также микроэлектроника, био- и медицинская технология для контроля содержания бактерий в ультрачистой воде. Сущность: исследуемую пробу фильтруют через мембранный фильтр. На дно стерильной чашки Петри помещают обеззоленный фильтр, смоченный фосфатным буфером "Зеренсона" с растворенным в нем 0,15%-ным метилтиозолилтетразолием бромистным. Чашки Петри помещают в термостат при 39 - 41°С. Через 60 - 75 мин окрашенные живые клетки микроорганизмов подсчитывают под микроскопом в проходящем свете.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ В ДЕИОНИЗИРОВАННОЙ ВОДЕ, предусматривающий отбор исследуемой пробы, фильтрацию ее через мембранный фильтр, введение последнего в питательную среду, содержащую индикатор, инкубирование микроорганизмов с последующим установлением их количества, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени, в качестве питательной среды используют фосфатный буфер с рН 8,2, а индикатор представляет собой водно-спиртовой раствор метилтиозолилтетразолия бромистого с концентрацией 0,15% при этом инкубирование микроорганизмов осуществляют при 39 41^oС в течение 60 75 мин.