Способ промышленного получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты.

Наиболее характерными представителями вагинального микробиоценоза являются Lactobacillus spp., составляющие до 95-98% от общего числа микроорганизмов в данной экологической нише. Общее количество лактобактерий у женщин репродуктивного возраста колеблется в широких пределах - 6-8 lg КОЕ/мл [1]. В микробиоте данной категории женщин выделяют четыре основных вида лактобацилл L. crispatus, L. gasseri, L. iners и L. jensenii, среди которых L. iners является одним из наиболее часто встречающихся видов. Это труднокультивируемый микроорганизм, не растет на традиционных питательных средах для лактобацилл (например, МRS-агаре). На кровяных средах L. iners формирует очень мелкие колонии, которые, как правило, не учитываются при бактериологическом исследовании вагинального отделяемого. Поэтому роль данного вида лактобацилл в функциональной стабильности вагинальной микробиоты до настоящего времени не определена. Выявление L. iners чаще всего осуществляется только с помощью молекулярно-биологических методов, которые не позволяют определять количественные показатели для этого микроорганизма в исследуемом материале.

В повседневной практике обследования женщин репродуктивного возраста широко применяется метод микроскопии вагинального мазка, окрашенного метиленовым синим, на так называемую «степень чистоты». В окрашенных мазках L. iners имеют схожие тинкториальные и морфологические свойства с Gardnerella vaginalis, этиологическим агентом неспецифического бактериального вагинита. В связи с этим в ряде публикаций отечественных и зарубежных исследователей описываются факты неправильной постановки диагноза бактериального вагиноза и последующего назначения антибактериальной терапии в случаях ошибочной идентификации L. iners.

Для правильной оценки состава микробиоты влагалища необходимо внедрение в повседневную практику питательных сред, позволяющих выделять L. iners в микробиологических лабораториях всех уровней.

Традиционный, самый экономичный, способ получения сухих питательных сред заключается в механическом смешивании сухих ингредиентов до однородного состояния [Хаптанова, Н.М. Конструирование питательной среды для культивирования листерий/ Н.М. Хаптанова, С.В. Лукьянова, В.И., Кузнецов, Н.Г. Гефан, Н.М. Андреевская, Ж.А. Коновалова, А.С. Остяк, В.С. Косилко // Acta biomedica scientifica. - 2020. - Т. 5, № 4. - С. 60-66].

Известна питательная среда для выделения и культивирования L. iners и других представителей вагинальной микробиоты, патент № 2794804 РФ, обладающая дифференцирующими свойствами, высокой чувствительностью и скоростью роста микроорганизмов и не требующая добавления крови. Приготовление известной питательной среды осуществляется лабораторным способом из отдельных ингредиентов, который при составе, включающем 12 ингредиентов, является трудоемким, что может приводить к ошибкам и нестандартности питательной среды из-за отсутствия надлежащего контроля качества исходных ингредиентов и готовой питательной среды в необходимом объеме, особенно контроля значения рН питательной среды для корректного проявления дифференцирующих свойств.

Производство питательной среды для выделения и культивирования L. iners и других представителей вагинальной микробиоты в сухом виде традиционным методом осложняется тем, что ингредиенты отличаются термотолерантностью и не могут быть смешаны вместе без потери ростовых свойств питательной среды, а один из ингредиентов - полисорбат 80 - представляет собой вязкую жидкость и входит в состав среды в небольшой концентрации (соотношение полисорбата 80 к остальным ингредиентам питательной среды составляет примерно 1:50), что может привести к неравномерному распределению жидкого полисорбата 80 с остальными сухими ингредиентами, ухудшению физико-химических и ростовых свойств питательной среды.

Известен способ получения антибактериальной фармацевтической композиции, содержащей твин-80 (или полисорбат 80), в форме таблеток, в данном способе готовится 33% водный раствор твина-80 (или полисорбата 80), им пропитываются основные сухие компоненты композиции, затем происходит обработка картофельным клейстером, гранулирование и сушка [Антибактериальная фармацевтическая композиция и способ ее получения: патент № 2182825 РФ]. Для осуществления данного способа смешивания полисорбата 80 с остальными ингредиентами требуется дополнительное оборудование для пропитки и гранулирования, что приводит к удорожанию процесса производства питательной среды.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является лабораторный способ получения питательной среды, по патенту № 2794804, заключающийся в приготовлении двух растворов ингредиентов (раствор №1 и раствор №2) в заданном соотношении, их раздельной стерилизации, объединении, перемешивании и розливе готовой среды в чашки Петри. Раствор №1 готовят, растворяя в дистиллированной или деионизованной воде сухой панкреатический гидролизат казеина, экстракт дрожжевой, L-лизина гидрохлорид, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-20, натрия пируват, полисорбат-80, магний сернокислый, бромкрезоловый пурпуровый и агар, после чего раствор стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 мин. Раствор №2 готовят, последовательно растворяя в дистиллированной или деионизованной воде цистеина гидрохлорид и L-глутамин, после чего раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм или 0,45 мкм. Затем в стерильный охлажденный до температуры (55±10)°С раствор 1 добавляют раствор 2, перемешивают взбалтыванием и разливают в чашки Петри.

Недостатком данного способа является короткий срок хранения приготовленной питательной среды (не более 14 дней) и невозможность получения ее в сухом виде. Еще одним недостатком данного способа является отсутствие обязательного контроля значений рН готовой питательной среды, обеспечивающих проявление ее дифференцирующих свойств по изменению цвета среды в зоне роста различных микроорганизмов в присутствии кислотно-основного индикатора бромкрезолового пурпурового. Известно, что граница перехода окраски индикатора от жёлтой к пурпурно-красной лежит в диапазоне pH от 5,2 до 6,8 [ГОСТ 4919.1-2016. Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов. - Введ. 2018-01-01. - М.: Изд-во стандартов, 2016. - 30 с.], т. е. при рН 5,2 он окрашивает среду в желтый цвет, а при рН 6,8 - в пурпурно-красный (или фиолетовый). Поэтому для четкого проявления дифференцирующих свойств в отношении лактобацилл и G. vaginalis питательная среда не должна иметь рН ниже 6,8. Иначе при получении вариантов питательной среды с рН ниже 6,8 ее цвет в чашках Петри будет не пурпурно-красный, а бледно-фиолетовый или серо-фиолетовый, и переход в желтый (для лактобацилл и G. vaginalis) или синий цвет (для стафилококков, эшерихий, энтерококков, кандид) трудно визуально оценить. Для проявления дифференцирующих свойств питательной среды этот показатель очень важен, и его необходимо всегда учитывать. Поэтому при приготовлении питательной среды лабораторным способом необходимо экспериментальным путем подбирать подходящие ингредиенты для обеспечения необходимого качества питательной среды и контролировать значение рН на всех этапах ее приготовления.

Техническим результатом настоящего изобретения является промышленное получение сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты с высокими ростовыми и дифференцирующими свойствами, стандартностью готовых серий и значением рН в диапазоне 6,9-7,3.

Технический результат достигается, тем что предложен способ промышленного получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты, включающий изготовление ее из двух компонентов - основы, состоящей из термоустойчивых ингредиентов, и ростовой добавки, состоящей из термолабильных ингредиентов, причем основу с рН 7,0-7,4, получают предварительно добавив в жидкий гидролизат казеина, полученный путем гидролиза казеина с поджелудочной железой при рН 8,0-8,2 и гидромодуле 1:10 не менее 4 ч, осветления при рН 4,0-4,5 и pH 7,8-8,2 и фильтрации, полисорбат 80 из расчета 1 кг на 10 кг сухого остатка с последующим высушиванием распылительным способом до влажности 3-5%, полученный сухой гидролизат казеина с полисорбатом 80 смешивают в течение 4-12 мин с сухими дрожжевым экстрактом, L-лизином гидрохлорида, стимулятором роста гемофильных микроорганизмов, мальтодекстрином с декстрозным эквивалентом 18-20, натрием пирувата, магнием сульфата, бромкрезоловым пурпуровым и агаром, а ростовую добавку с рН 1,6-2,0 получают растворением в дистиллированной воде L-цистеина гидрохлорида, L-глутамина и никотинамидадениндинуклеотида, стерилизацией полученного раствора методом мембранной фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм, розливом в асептических условиях в стеклянные емкости, замораживанием при температуре от минус 20 до минус 50°C, лиофильным высушиванием при температуре от минус 50°C до плюс 30°C до получения пористой массы с остаточной влажностью не более 4% и укупориванием емкостей.

Отличием предлагаемого способа является получение сухой питательной среды, состоящей из двух сухих компонентов: основы и ростовой добавки, причем, сухую основу получают с рН 7,0-7,4 для улучшения ее дифференцирующих свойств, а сухую ростовую добавку с рН 1,6-2,0 получают методом лиофильной сушки стерильного водного раствора термолабильных ингредиентов.

Способ осуществляется следующим образом:

1. В жидкий ферментативный гидролизат казеина, полученный путем гидролиза с поджелудочной железой (из расчета 5 кг поджелудочной железы на 10 кг казеина) при температуре (50±2)°C и рН 8,0-8,2 не менее 4 ч, осветления и фильтрации (осветления в кислой среде при значении рН 4,0-4,5 и температуре кипения в течение 10-15 мин, фильтрации при температуре (90±5)°С, выдерживания полученного гидролизата при значении pH 7,8-8,2 при температуре кипения в течение 10-15 мин, повторной фильтрации при температуре (90±5)°С, добавляют полисорбат 80 (из расчета 1 кг полисорбата 80 на 10 кг сухого остатка гидролизата), перемешивают полученную смесь и в течение 30-40 мин и высушивают на распылительной сушилке при температуре воздуха на входе в сушильную камеру - (190±1)°С, на выходе - (93±3)°С до влажности 3-5%. Значение рН высушенного гидролизата казеина с полисорбатом 80 составляет 7,2-7,6.

2. Сухую основу питательной среды получают смешиванием, в лопастном смесителе сухих ингредиентов в следующем соотношении: 5,5 кг ферментативного гидролизата казеина, высушенного с полисорбатом 80, 5 кг дрожжевого экстракта, 5 кг L-лизина гидрохлорида, 2,5 кг стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 2,5 кг мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 0,5 кг натрия пирувата, 50 г магния сульфата, 25 г бромкрезолового пурпурового и (6±1) кг агара (варьирование величины связано с различной прочностью студня агара) в течение от 4 до 12 мин. Значение рН сухой основы питательной среды 7,0-7,4.

3. Получение ростовой добавки осуществляют растворением в 2500 мл дистиллированной воды ингредиентов в соотношении 250 г L-цистеина гидрохлорида, 100 г L-глутамина, 1 г никотинамидадениндинуклеотида, стерилизацией полученного раствора через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм с последующим розливом по 2,5 или 5,0 мл во флаконы, замораживанием при температуре от минус 20°C до минус 50°C и лиофильным высушиванием при температуре от минус 50°C до плюс 30°C. Значение рН высушенного гидролизата казеина с полисорбатом 80 составляет 1,6-2,0.

Полученное по вышеописанному способу количество сухой питательной среды (включающей сухую основу и сухую ростовую добавку) позволяет приготовить в лаборатории до 500 л готовой питательной среды с одинаковыми физико-химическими показателями (содержание аминного азота, влажность, рН) и специфической активностью (чувствительность питательной среды, дифференцирующие свойства, скорость роста и стабильность морфологических свойств микроорганизмов).

Для приготовления готовой питательной среды в лаборатории 54,15±2,0 г основы тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения, стерилизуют в автоклаве при температуре 121°C в течение 15 мин. В асептических условиях вскрывают 1 флакон или 2 флакона с ростовой добавкой, необходимыми для приготовления 1 л питательной среды, и растворяют содержимое в 5 мл или 2,5 мл стерильной дистиллированной водой. В охлаждённую до температуры (55±5)°С основу в асептических условиях вводят раствор ростовой добавки, перемешивают взбалтыванием и разливают в стерильные чашки Петри, закрывают крышками и ставят для застывания при комнатной температуре. Продолжительность приготовления питательной среды составляет примерно 10 мин без учета времени автоклавирования.

Ниже приведены примеры обоснования выбранного способа получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты

Пример 1. Получение сухой питательной среды

В реакторе растворяют 75 кг казеина в 750 л питьевой воды при температуре (80±2) °С, гидролиз ведут при рН 8,0-8,2 и температуре (50±2) °C в течение 4 ч с 37,5 кг поджелудочной железы при постоянном перемешивании. Гидролизную смесь осветляют при рН 4,0-4,5 и нагревании до температуры кипения и фильтруют. Затем доводят рН осветленного гидролизата до значения 7,8-8,2 и повторно фильтруют. Вносят полисорбат 80 из расчета на 1 кг на 10 кг сухого гидролизата.

Гидролизат с полисорбатом 80 перемешивают в течение 40 мин до полного растворения и высушивают на распылительной сушилке при температуре воздуха на входе в сушильную камеру - (190±1)°С; температура воздуха на выходе из сушильной камеры - (93±3)°С.

Сухую основу питательной среды получают смешиванием в течение 4 мин в лопастном смесителе следующих ингредиентов: 5,5 кг ферментативного гидролизата казеина, высушенного с полисорбатом 80, 5 кг дрожжевого экстракта, 5 кг L-лизина гидрохлорида, 2,5 кг стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 2,5 кг мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 0,5 кг натрия пирувата, 50 г магния сульфата, 25 г бромкрезолового пурпурового и 6,0 кг агара, с последующей фасовкой по 100 г - 250 г в полиэтиленовые банки вместимостью 200-600 мл.

Ростовую добавку получают путем растворения в 2500 мл дистиллированной воды 250 г L-цистеина гидрохлорида, 100 г L-глутамина и 1 г никотинамидадениндинуклеотида, стерилизации полученного раствора через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм, затем разливают по 2,5 мл во флаконы, замораживают в течение 5 ч при температуре минус 40°C, лиофильно высушивают при температуре минус 40°C в течение 1,5 ч, с последующим подъемом температуры до минус 20°C в течение 2 ч и сушки в течение 7 ч, последующего подъема температуры до плюс 25°C в течение 4 ч и окончательной сушки при этой температуре в течение 5 ч, укупоривания флаконов.

Для оценки специфической активности готовят 3 варианта питательной среды, для чего используют три банки с сухой основой и шесть флаконов с ростовой добавкой. В данном случае питательную среду готовят суспендированием 54,15 г сухой основы в 1 л дистиллированной воды, нагреванием до кипения, стерилизацией в автоклаве при температуре 121°C в течение 15 мин. После охлаждения до (55±10)°С в 1 л стерильной основы вносят содержимое двух флаконов с ростовой добавкой, каждый из которых предварительно растворяют в 2,5 мл стерильной дистиллированной воды, перемешивают взбалтыванием и разливают в стерильные чашки Петри. Контролируют значение рН. Продолжительность приготовления питательной среды одного варианта составила - 10 мин без учета времени автоклавирования.

Специфическую активность питательной среды оценивают путем посева тест-штаммов Lactobacillus iners DSM 13335, Lactobacillus crispatus ATCC 33820, Gardnerella vaginalis DSM 14018, Escherichia coli ATCC 25922, Haemophilus influenzae ATCC 49247 и Candida albicans ATCC 60193. Дополнительно определяют среднее арифметическое количество и диаметр колоний тест-штаммов Lactobacillus iners DSM 13335, Lactobacillus crispatus ATCC 33820 и Gardnerella vaginalis DSM 14018, выросших через 48 ч инкубирования при температуре (37±1)°C в атмосфере 5-10% CO₂ при посеве их из разведения 10^-5.

Исходные микробные взвеси тест-штаммов готовят в 0,9% растворе хлорида натрия и доводят концентрацию до 10 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-25-59-85 П. Из исходных взвесей готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл взвеси культуры в 4,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия до разведения 10^-5. Проводят посев по 0,1 мл взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10^-5 на три чашки Петри со средой, приготовленной по данному примеру и на три чашки Петри со средой, приготовленной по примерам 2-3. Учет результатов проводят через 48 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С в микроаэрофильных условиях в атмосфере 5% СО₂.

Результаты оценки специфической активности и физико-химические показатели питательной среды представлены в табл. 1-3.

Пример 2. Получение сухой питательной среды

В реакторе растворяют 75 кг казеина в 750 л питьевой воды при температуре (80±2)°С, гидролиз ведут при рН 8,0-8,2 и температуре (50±2)°C в течение 4 ч с 37,5 кг поджелудочной железы при постоянном перемешивании. Гидролизную смесь осветляют при рН 4,0-4,5 и нагревании до температуры кипения и фильтруют. Затем доводят рН осветленного гидролизата до значения 7,8-8,2 и повторно фильтруют. Вносят полисорбат 80 из расчета на 1 кг на 10 кг сухого гидролизата.

Гидролизат с полисорбатом 80 перемешивают в течение 30 мин до полного растворения и высушивают на распылительной сушилке при температуре воздуха на входе в сушильную камеру - (190±1)°С; температура воздуха на выходе из сушильной камеры - (93±3)°С.

Сухую основу питательной среды получают смешиванием в течение 12 мин в лопастном смесителе следующих ингредиентов: 5,5 кг ферментативного гидролизата казеина, высушенного с полисорбатом 80, 5 кг дрожжевого экстракта, 5 кг L-лизина гидрохлорида, 2,5 кг стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 2,5 кг мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 0,5 кг натрия пирувата, 50 г магния сульфата, 25 г бромкрезолового пурпурового и 6,0 кг агара, с последующей фасовкой по 100 г - 250 г в полиэтиленовые банки вместимостью 200-600 мл.

Сухую ростовую добавку получают путем растворения в 2500 мл дистиллированной воды 250 г L-цистеина гидрохлорида, 100 г L-глутамина и 1 г никотинамидадениндинуклеотида, стерилизации полученного раствора через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм, розлива по 5 мл во флаконы, замораживания в течение 4 ч при температуре минус 50°C, лиофильного высушивания при температуре минус 50°C в течение 1 ч, последующего подъема температуры до минус 15°C в течение 2 ч и сушки в течение 7 ч, последующего подъема температуры до плюс 25°C в течение 4 ч и окончательной сушки при этой температуре в течение 5 ч, укупоривания флаконов.

Для оценки специфической активности готовят 3 варианта питательной среды, для чего используют три банки с сухой основой и три флакона с ростовой добавкой. В данном случае питательную среду готовят суспендированием 54,15 г сухой основы в 1 л дистиллированной воды, нагреванием до кипения, стерилизацией в автоклаве при температуре 121°C в течение 15 мин. После охлаждения до (55±10)°С в 1 л стерильной основы вносят содержимое одного флакона с ростовой добавкой, которую предварительно растворяют в 5 мл стерильной дистиллированной воды, перемешивают взбалтыванием и разливают в стерильные чашки Петри. Контролируют значение рН. Продолжительность приготовления питательной среды одного варианта составила - 10 мин без учета времени автоклавирования.

Оценка специфической активности питательной среды аналогична примеру 1.

Пример 3. Получение питательной среды лабораторным способом по прототипу

Приготовление питательной среды осуществляют в соответствии с описанием патента № 2794804. Продолжительность приготовления питательной среды составляет примерно 1 ч без учета времени автоклавирования.

Значение рН готовой среды составило 6,6. Цвет среды бледно-фиолетовый.

Оценка специфической активности питательной среды аналогична примеру 1.

Только при способе получения питательной среды по примерам 1 и 2 (по формуле изобретения) достигается указанный технический результат: получение сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты с высокими ростовыми и дифференцирующими свойствами, со сроком годности до двух лет, сокращением времени приготовления готовой питательной среды перед проведением исследования стандартностью показателей качества готовых серий и значением рН в диапазоне 6,9-7,3, позволяющим четко проявлять дифференцирующие свойства в отношении L. iners и G. vaginalis.

Предложенный способ промышленного получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты позволяет получить стандартизованные серии сухой питательной среды с рН 6,9-7,3 со стабильно высокими ростовыми свойствами (выраженные в виде специфической активности), не отличающимися от таковых на среде лабораторного изготовления, полученной по прототипу с дополнительной корректировкой рН (при необходимости), повысить проявление дифференцирующих свойств, эффективность исследования за счет сокращения этапов технологического процесса (проведения контроля качества) и времени на приготовление питательной среды перед использованием в работе.

Способ промышленного получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты.

Таблица 1

Характер роста тест-штаммов при посеве из разведения 10^-5 через 48 ч инкубирования при температуре (37±1)°C в атмосфере 5-10% CO₂ на питательных средах, приготовленных по примерам

Тест-штамм Предлагаемый способ
(рН 6,9-7,3) Лабораторный способ приготовления (по прототипу (контроль),
рН готовой среды 6,6 L. iners DSM 13335 Колонии типичные светло-коричневые диаметром 0,7±0,1 мм;
изменение цвета среды с пурпурно-красного на желтый Колонии типичные светло-коричневые диаметром 0,6±0,1 мм;
изменение цвета среды с бледно-фиолетового на бледно-желтый трудно выявить невооруженным взглядом G. vaginalis ATCC 1408 Колонии типичные лимонно-желтого цвета диаметром 0,7±0,1 мм;
изменение цвета среды с пурпурно-красного на желтый Колонии типичные лимонно-желтого цвета диаметром 0,6±0,1 мм;
изменение цвета среды с бледно-фиолетового на бледно-желтый трудно выявить невооруженным взглядом L. crispatus ATCC 33820 Колонии типичные серовато-коричневые диаметром 1,6±0,4 мм;
изменение цвета среды с пурпурно-красного на желтый Колонии типичные серовато-коричневые диаметром 1,5±0,4 мм;
изменение цвета среды с бледно-фиолетового на бледно-желтый трудно выявить невооруженным взглядом C. albicans ATCC 60193 Колонии через 24 ч типичные плоские матовые темно-серые диаметром 1,6-1,8 мм;
изменение цвета среды с пурпурно-красного на синий Колонии через 24 ч типичные плоские матовые темно-серые диаметром 1,6-1,8 мм
изменение цвета среды с бледно-фиолетового на бледно-синий трудно выявить невооруженным взглядом E. coli ATCC 25922 Колонии через 24 ч типичные белого цвета диаметром 1,2-1,4 мм;
изменение цвета среды с пурпурно-красного на синий Колонии через 24 ч типичные белого цвета диаметром 1,0-1,2 мм,
трудно выявить невооруженным взглядом изменение цвета среды с бледно-фиолетового на бледно-синий
H. influenzae ATCC 49247 Колонии через 24 ч типичные серовато-белого цвета диаметром 1,0-1,2 мм; нет изменения цвета Колонии через 24 ч типичные серовато-белого цвета диаметром 0,9-1,0 мм;
нет изменения цвета

Таблица 2

Среднее арифметическое количество и диаметр колоний тест-штаммов, выросших при посеве из разведения 10^-5 через 48 ч инкубирования при температуре (37±1)°C в атмосфере 5-10% CO₂ на питательных средах, приготовленных по примерам для трех образцов

Питательная среда, приготовленная по примерам Образец Тест-штамм L. iners DSM 13335 G. vaginalis ATCC 1408 L. crispatus ATCC 33820 1
По формуле изобретения Образец 1 Образец 2 Образец 3 2
По формуле изобретения Образец 1 Образец 2 Образец 3 3
Прототип Образец 1 Образец 2 Образец 3 Примечание:
* - среднее арифметическое количество колоний
** - диаметр колоний, мм

Таблица 3

Физико-химические свойства питательных сред, полученных по предлагаемому способу и прототипу

Показатель Предлагаемый способ получения питательной среды по примерам
1-2 Способ прототип (лабораторная методика) Основа Добавка Основа Добавка рН 7,0-7,4 1,8-2,0 Необходимо подобрать гидролизат казеина с нужными характеристиками и другие ингредиенты Влажность,% 4,5 3,1 Н.о.* Н.о.* Готовая питательная сред в чашках Петри рН 7,0 6,6 Цвет Пурпурно-красный Бледно-фиолетовый Время приготовления 10 мин 1ч Дополнительное оборудование и реактивы рН метр Аналитические весы с погрешностью; Мембранный фильтр размером пор 0,22 мкм;
рН метр;
соляная кислота;
натр едкий Примечание:
*Н.о. - не определяется для питательной среды, разлитой в чашки Петри

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты. Сущность изобретения: жидкий гидролизат казеина смешивают с полисорбатом 80 из расчета 1 кг полисорбата на 10 кг гидролизата казеина, сушат, а затем смешивают с остальными сухими компонентами питательной среды, а ростовую добавку получают растворением с последующей стерилизацией, замораживанием и высушиванием. Предложенный способ промышленного получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты позволяет получить стандартизованные серии сухой питательной среды с рН 6,9-7,3 со стабильно высокими ростовыми свойствами. 3 табл.

Способ промышленного получения сухой питательной среды для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты, включающий изготовление ее из двух компонентов - основы, состоящей из термоустойчивых ингредиентов, и ростовой добавки, состоящей из термолабильных ингредиентов, отличающийся тем, что основу с рН 7,0-7,4 получают, предварительно добавив в жидкий гидролизат казеина, полученный путем гидролиза казеина с поджелудочной железой при рН 8,0-8,2 и гидромодуле 1:10 не менее 4 ч, осветления при рН 4,0-4,5 и pH 7,8-8,2 и фильтрации, полисорбат 80 из расчета 1 кг на 10 кг сухого остатка с последующим высушиванием распылительным способом до влажности 3-5%, затем 5,5 кг полученного сухого гидролизата казеина с полисорбатом 80 смешивают в течение 4-12 мин с 5 кг сухого дрожжевого экстракта, 5 кг L-лизина гидрохлорида, 2,5 кг стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 2,5 кг мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 0,5 кг натрия пирувата, 50 г магния сульфата, 25 г бромкрезолового пурпурового и 6,0 кг агара, а ростовую добавку с рН 1,6-2,0 получают растворением в 2500 мл дистиллированной воды 250 г L-цистеина гидрохлорида, 100 г L-глутамина и 1 г никотинамидадениндинуклеотида, стерилизацией полученного раствора методом мембранной фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм, розливом в асептических условиях в стеклянные емкости, замораживанием при температуре от минус 20 до минус 50°C, лиофильным высушиванием при температуре от минус 50°C до плюс 30°C до получения пористой массы с остаточной влажностью не более 4%.