СПОСОБ ОБРАЗОВАНИЯ ОДНО- И ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ В ДНК И ИНДУЦИРОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У КУКУРУЗЫ Российский патент 1995 года по МПК A01H1/04 C12N15/01 

Изобретение относится к биологии, а именно к генетике, и может быть использовано в селекции сельскохозяйственных растений для получения разнообразного исходного материала, например кукурузы.

Образование разрывов в молекуле ДНК и индуцирование хромосомных аберраций может быть осуществлено за счет двухквантовой афинной модификации (ДАМ). Селективность при осуществлении этого метода обеспечивается за счет применения красителей, избирательно образующих комплексы с биологическими микромолекулами определенного класса. Такие красители, как псоралены, акридины, бромистый этидий с молекулой ДНК, в основном образуют комплексные связи по типу интеркалирования. Активация таких комплексов лазерным излучением (ЛИ) приводит к образованию разрывов в молекуле ДНК за счет переноса энергии с прижизненного красителя на ДНК. Эти разрывы в процессе индивидуального развития организма реализуются в разнообразные мутации.

Известен способ образования разрывов в ДНК и индуцирования хромосомных аббераций, заключающийся в том, что для образования разрывов в ДНК и получения хромосомных аберраций используют лазерное излучение (длина волны 337,1 нм) и прижизненные красители бромистый этидий (Et. Br.) и акридин оранжевый (АО) [1]
Однако этот способ недостаточно эффективен, т.к. облучение клеток лазером ( λ337,1 нм) в присутствии данных хромофоров-фотосенсибилизаторов повышает частоту хромосомных аберраций примерно в два-три раза.

Задача изобретения увеличить выход одно- и двунитевых разрывов в ДНК и хромосомных аберраций у сельскохозяйственных растений, в частности у кукурузы.

Задача решается предлагаемым способом образования разрывов в ДНК и индуцирования хромосомных аберраций у кукурузы, в котором в качестве прижизненного красителя фотосенсибилизатора используют 6-меркаптопурин (6 МП). Использование данного красителя в сочетании с лазерным излучением ( λ 337,1 нм) в 2,5 и 5 раз увеличивает эффективность образования разрывов в ДНК кукурузы и 3,8 и 8,5 раз частоту хромосомных аберраций в митотических клетках кукурузы по сравнению с бромистым этидием и акридином оранжевым соответственно.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделяют ДНК из молодых листьев кукурузы известным способом (Клонирование ДНК. Методы. М. Мир, 1988, с. 362-363), готовят комплекс ДНК 6 МП в 0,1 х SSC буфере в соотношении 1:5. Концентрации: ДНК 100 мкг/мл и 6 МП 1˙10^-5 М. Затем комплекс активируют лазерным излучением ( λ 337,1 нм) в течение 1 мин. Плотность мощности 0,7˙10⁸ Вт/м².

Оценку эффективности проводят по количеству разрывов в ДНК, выявляемых методом электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле при напряженности 1 В/см, в течение 16-18 ч.

Данные представлены в табл. 1.

Из данных, представленных в табл. 1 видно, что при использовании в качестве красителя 6 МП удается увеличить эффективность образования разрывов в ДНК в 2,5 раза по сравнению с применением бромистого этидия и в 5 раз по сравнению с акридином оранжевым.

Оценку мутагенной активности по хромосомным аберрациям проводят следующим образом.

Проросшие корешки кукурузы длиной 3-4 мм замачивают на 24 ч в красителе 6 МП при концентрации 1˙10^-5, а затем тщательно отмывают в дистиллированной проточной воде. Непосредственно после промывки подвергают обработке лазерным излучением ( λ 337,1 нм) в течение 1 мин при плотности мощности 0,7˙10⁸ Вт/м². По завершению облучения корешки фиксируют и готовят препараты известным способом. (Паушева З. П. Практикум по цитологии растений. М. Колос, 1974).

Частоту хромосомных аберраций подсчитывают в ана- и телофазах митоза по традиционной методике (Гостимский С.А. и др. Практикум по цитогенетике. М. 1974).

Данные представлены в табл. 2.

Анализ данных табл. 2 показывает, что предлагаемый способ позволяет увеличить частоту хромосомных аберраций в 3,8 и 8,5 раз по сравнению с известным способом, где используют в качестве красителей бромистый этидий и акридин оранжевый соответственно.

Следовательно, предлагаемый способ позволяет значительно увеличить эффективность образования разрывов в ДНК кукурузы и частоту хромосомных аберраций в митотических клетках кукурузы, что в конечном итоге даст возможность расширить спектр исходного материала при селекции кукурузы.

Использование: биотехнология, селекционно-генетические исследования, мутагенез растений. Сущность изобретения: различные хромосомные аберрации у кукурузы получают путем воздействия на клетки лазерным излучением длиной волны 337,1 нм в присутствии 6-меркаптопурина. 2 табл.

СПОСОБ ОБРАЗОВАНИЯ ОДНО- И ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ В ДНК И ИНДУЦИРОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У КУКУРУЗЫ, включающий облучение клеток лазерным излучением длиной волны 337,1 нм в присутствии красителя-сенсибилизатора, отличающийся тем, что в качестве красителя-сенсибилизатора, используют 6-меркаптопурин.