Способ определения жизнеспособности клеток Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 G01N21/64 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к контролю за состоянием клеточных культур, и может быть-использовано в токсикологии, цитодиагностике и в экологии и охране окружающей среды (тестирование загрязнений на цитотоксичность

Целью изобретения является повыше-ние точности способа

Изобретение заключается в том,, что при окрашивании суспензии клеток в качестве красителя используют смесь акридинового оранжевого (АО ) и бро- . мистого этидия (БЭ) в соотношении 1:3 (напро 7 мкг/мп АО и 20 мкг/мл

БЭ для концентраций клеточных суспензий (0,5-3).10 кл/мл), а различия в флуоресценции живых и мертвых клеток регистрируют по интенсивности их свечения в одном и том же спектральном диапазоне.

Это позволяет раздвинуть и стабилизировать положения максимумов кривы.х распределения живых и мертвых клеток на гистограмме, а также сузить область распределения живых клеток примерно в 3-4 раза по сравнению с прототипом (не меняя общей площади под кривой распределения), и таким .образом полностью исключить основной источник ошибки- анализа - перекрывание областей распределения двух ти«пов клеток. Регистрация различий по интенсивности флуоресценции позволяе заменить дорогостоящее импортное обо рудование на отечественное, а применение более простой в эксплуатации смеси красителей (АО вместо фпуорес цеиндиацетата ФДА) снижает трудоемкость способа и дает возможность использовать более доступный отечестве ный реактив. В этой смеси широко используемый краситель АО проявляет новое свойство - способность окрашивать живые и мертвые клетки таким образом, что он отличаются друг от друга не только разным цветом свечения, но и интенси ностью этого разноцветного свечения о Это дает возможность регистрировать дифференциацию живых и мертвых клето одним фотоэлектронным детектором в одной полосе флуоресценции, применив для этого одноканальный проточный цитофлуориметр. Такая регистрация обеспечивает автоматизацию. процесса анализа, объективность результатов и как следствие этого, более высокую точность, а также быстроту их получениЯоПример, К 1 мл каждой из 10 идентичных проб анализируемой сус пензии лимфоцитов человека (фракцию мононуклеарных клеток выделяют из крови здоровых доноров с помощью центрифугирования}.в среде 199 (концентрация 1,2-10 кл/мл ) добавляют 20 мкл раствора бромистого этидия (концентрация 1 мг/мп) и 7 мкл раствора акридинового оранжевого (концен рация 1 мг/мл)о Перемешивают и инкубируют 20 мин при 20 С о Далее пробы анализируют на проточном цитометре Получают 10 сходных гистограмм Анализ гистограмм дал результат: живых клеток 92+3%о одновременно те же окрашенные 10 проб анализируют под мик роскопом (объектив 40 V 0,65) тра диционным методом, Получают результат: живых клеток 84,51:6,5%, Время, затраченное непосредственно на анализ методом проточной цитометрии, составляет 25 мин-для 10 проб, в то время, как для проведения ана,лиза тех же 10 проб традиционным методом микроскопии потребовалось 2 чо При этом средняя величина второго результата несколько меньше, чем пер вого. Это снижение происходит за счет гибели части клеток в процессе их подсчета под микроскопом. Таким образом,.способ позволяет с меньшей статистической и систематической погрешностью и за меньшее время определять соотношение живых и мертвых клеток животных по сравнению с традиционш)1м методом анализа клеток под микроскопом, П р и м е р 2о Отбирают 1 мл суспензии клеток тимуса мьшш в растворе версена (концентрация 2 -10 кл/мл), добавляют 20 мкл раствора БЭ (концентрация 1 мг/мл ) и 7 мкл раствора АО (концентрация 1 мг/мл, перемешивают, инкубируют 20 мин при , анализируют 0,5 мл пробы на проточном цитофлуориметрво В канале возбуждения светофильтр СС - 15-4, в канале регистрации - светофильтр ОС-11 и зеленая светоделительная пластинка из набора микроскопа ЛЮМАМ И1, Регистрируют гистограмму и количество клеток в левом (9 -101 Ю кл }и правом ( 9- 576л х10 кл ) пикахо Число клеток в пике пропорционально площади под соответствующей кривой в пределах визуально выбранных границ по оси абсцисс и подсчитывается автоматически с помощью анализатора импульсов, входящего в состав проточного цитофлуориметра. Получают результат; живых клеток 91,32%, мертвых клеток 8,68%. Параллельно с анализом на цитофлуориметре доли живых и мертвых клеток в той же окрашенной пробе подсчитывают с помощью камеры Горяева под люминесцентным микроскопом, что требует значительно больше времени и труда. Результаты этого анализа (9,1%+0,5+ мертвых клеток) не отличаются от результатов анализа пробы на проточном цитофлуориметре в пределах 5% по относительной величине, ПримерЗоК1мл пробы из анализируемой суспензии клеток тимуса мьшги в растворе версана (концентрация 1,5-10 кл/мл) добавляют 20 мкл раствора БЭ (концентрация 1 мг/мл) и 7 мкл раствора АО (концентрация 1 мг/мл), перемешивают и инкубируют 20 мин при . Анализируют 0,5 мл пробы на одноканальном проточном цитофлуориметре, как описано в примере 2, Регистрируют гистограмму и определяют соотношение живых (88,3%) и мертвых (11,7%) клеток. Одновременно к I мл другой пробы этой же анализируемой суспензии добавляют 50 мкл раствора ФДА, концент рация 10 мкг/мл, и 10 мкл раствора Б перемешивают и инкубируют 23 мин при , Анализируют 0,5 m этой пробы на проточном цитофлуориметре. Регист рируют соответствующую гистограмму, но соотношение живых и мертвых клето нельзя определить из-за невозможност точно опредешть область распределения мертвых клеток, Кроме того, к 1 МП третьей пробы из той же анализируемой суспензии до бавляют 20 мкл раствора АО, перемешивают и инкубируют 20 мин при 20°С, Анализируют 0,5 мл этой пробы на про точном цитофпуориметре, как описано вьшео Регистрируют соответствующую гистограмму, но соотношение живых и мертвых кпеток нельзя определить из-за перекрывания областей распределения живых и мертвых клеток Результаты сравнительного анализа всех трех зарегистрированных гистограмм показывают, что только в случа окраски клеток смесью красителей БЭ и АО области распределения живых и мертвых клеток хорошо разделяются, что дает возможность с высокой точностью определить в этом случае соот ношение тех и других клеток в суспен зии. При окраске клеток одним краси.телем АО живые и мертвые клетки не разделяются по интенсивности их люми несценции. Известная окраска клеток смесью красителей ФДА и БЭ также не дает возможности разделять жи-вые и мертвые клетки при одноканальной регистрации, Таким образом, при использовании способа существенно повышается точность измерения при снижении трудоеьгкости анализа и его удешевление за счет появления возможиости применения отечественных регистрирующего устройства и красителей. Кроме того, способ дает возможность определять соотношение живых и мертвых клеток неавтоматизированным способом - подсчетом клеток при наблюдении под люминесцентным микроскопом (в случае отсутствия проточного цитофлуориметра)г Формула изобретения Способ определения жизнеспособности клеток, включающий получение суспензии клеток в солевом растворе, обработку суспензии раствором этидиума бромида в смеси с флуор охр омом, возбуждение флуоресценции в синей области спектра с последующей регистрацией флуоресценции и количественной оценкой живых и мертйых клеток по гистрограмме распределения, отличающийся тем, что, с целью повьшгенйя точности, суспензию клеток получают с концентра-, цией (0,5-5)-10 кл/мп, этидиум бромид используют в смеси с акридиновым оранжевым в количестве 20 и 7 мкг/мл соответственно, флуоресценцию регистрируют в спектральном диапазоне 520700 нм, а оценку осуществляют на гистограмме распределения клеток по интенсивности флуоресценции в этом спектральном диапазоне,

Изобретение относится к области биотехнологии, а также может быть использовано в медицине, в экологии и охране окружающей среды, в фундаментальной биологии клетки, при контроле за состоянием клеточных культур. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого окрашивание анализируемой суспензии клеток производят смесью красителей акридиновый оранжевый и бромистый этидий в соотношении 1:3. Доли живых и мертвых клеток регистрируют путем автоматического раздельного подсчета на проточном цитофлуориметре числа тех и других клеток, различающихся по интенсивности свечения (в одном спектральном диапазоне). Повышение точности способа достигается в результате устранения перекрывания областей распределения (по интенсивности свечения) двух типов клеток, снижение трудоемкости анализа и его удешевление - за счет появления возможности применения более простых в эксплуатации отечественных регистрирующего устройства (одноканального проточного цитофлуориметра) и красителя (акридинового оранжевого).