СЕНСИБИЛИЗАТОР-ИНТЕРКАЛЯТОР Российский патент 1994 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к генетике, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений и представляет собой применение 6-меркаптопурина в качестве сенсибилизатора-интеркалятора.

К основным средствам индуцирования искусственных мутаций и рекомбинаций у растений относятся ионизирующее излучение, лазерное излучение, химические мутагены. Все виды воздействий указанными средствами должны обладать определенной селективностью в плане преимущественного действия на генетический аппарат растительной клетки, в частности на нуклеиновые кислоты. Имеет большое значение и точное определение момента времени воздействия, например воздействие в момент волны митозов. Все указанные средства, индуцирующие мутации и рекомбинации, должны в наименьшей степени затрагивать негенетические структуры клетки, так как в противном случае в дальнейшем уменьшается вероятность реализации мутаций и рекомбинаций.

Для выполнения требований селективности воздействия на нуклеиновые кислоты и воздействия в момент, соответствующий определенному состоянию развития биологического объекта, в наибольшей мере подходит способ совместного действия лазерного излучения и сенсибилизаторов-интеркаляторов, в котором в качестве сенсибилизаторов-интеркаляторов используются этидиум бромистый (EtBr) и акридин оранжевый (АО).

Однако использование указанных веществ в качестве сенсибилизаторов-интеркаляторов предполагает достаточно высокую степень насыщения нуклеиновых кислот молекулами красителей. In vitro наилучшие результаты образования однонитевых и двунитевых разрывов достигаются в ДНК при связывании интеркаляторов с молекулой ДНК в соотношении 1: 5, т. е. на 5 пар нуклеотидов ДНК приходится одна молекула связанного интеркалятора. In vivo, при замачивании семян в растворах интеркаляторов резкое увеличение числа хромосомных аберраций после облучения лазерным излучением наблюдается при концентрациях интеркаляторов, близких к токсическим концентрациям. Кроме того, при использовании EtBr происходит сильное связывание EtBr с ДНК, что препятствует в дальнейшем выводу EtBr из клетки после облучения лазерным излучением. АО легко выводится из клетки, но обладает малой сенсибилизирующей способностью при облучении ультрафиолетовым лазерным излучением.

Заявляемый в качестве интеркалятора-сенсибилизатора 6-меркаптопурин имеет следующие характеристики. 6-меркаптопурин применяется в медицине для лечения злокачественных новообразований. 6-меркаптопурин является антиметаболитом пуринов. По строению близок к аденину и гипоксантину. Структурная формула
При добавлении в раствор с ДНК 6-меркаптопурина происходит активное комплексообразование ДНК-6-меркаптопурин. Встроенный в цепь ДНК 6-меркаптопурин способен избирательно поглощать лазерное излучение в УФ-области и передавать возбуждение на молекулу ДНК, вызывая однонитевые и двунитевые разрывы в ДНК. 6-меркаптопурин имеет максимум поглощения в диапазоне 330-350 нм. Поэтому наиболее эффективно он будет проявлять свойства сенсибилизатора (приемника излучения) при облучении лазером с длиной волны излучения, попадающей в указанный диапазон. Из существующих лазеров указанным требованиям в наибольшей степени удовлетворяет азотный лазер ЛГИ-21 с длиной волны излучения λ= 337 нм. При совместном использовании 6-меркаптопурина и лазера ЛГИ-21 эффективность образования однонитевых и двунитевых разрывов в ДНК возрастает на порядок (по сравнению с прототипом), то есть если для получения определенного количества однонитевых и двунитевых разрывов в ДНК с использованием EtBr, АО и ЛГИ-21 требуется связывание с ДНК интеркаляторов в соотношении 1: 5, то в случае использования 6-меркаптопурина и ЛГИ-21 такое же количество разрывов в ДНК возникает при связывании интеркалятора с ДНК в соотношении 1: 50. При этом дозы лазерного излучения в обоих случаях были одинаковыми. Высокая эффективность 6-меркаптопурина в качестве сенсибилизатора лазерного излучения позволяет значительно снизить концентрацию 6-меркаптопурина в растворе при замачивании семян растений до значений, не вызывающих токсичности. Для разных видов растений подобные концентрации определяются на основании опытов. Перед совместным применением 6-меркаптопурина и лазерного излучения определяется доза лазерного излучения, которая должна быть в пределах, удовлетворяющих нормальному развитию облученных растений. Для разных видов растений и для разных состояний развития растений доза облучения лазером также подбирается опытным путем. Таким образом, при раздельном воздействии ни 6-меркаптопурин, ни лазерное излучение не вызывают увеличения числа хромосомных аберраций в сравнении с контролем. При совместном же действии указанных факторов выход хромосомных аберраций резко возрастает.

По проведенным экспериментам на корешках кукурузы (Zea mays) были получены следующие результаты. (таблица): Проведенный эксперимент потверждает возможность применения 6-меркаптопурина в качестве эффективного сенсибилизатора-интеркалятора.

Техническим результатом применения 6-меркаптопурина в качестве сенсибилизатора-интеркалятора является создание нового эффективного сенсибилизатора-интеркалятора, в наибольшей степени отвечающего всем требованиям практического мутагенеза.

Заявленный 6-меркаптопурин в качестве сенсибилизатора-интеркалятора при совместном действии с лазерным излучением может быть эффективно использован в народном хозяйстве в целях практического мутагенеза для расширения спектра исходных форм селекции. (56) 1. Бурилков В. К. , Крочик Г. М. Биологическое действие лазерного излучения. Кишинев: Штиинца, 1989, с. 21-32.

Использование: биотехнология, растениеводство, селекционно-генетические исследования. Сущность изобретения: 6-меркаптопурин применяют в качестве сенсибилизатора-интеркалятора и используют при мутагенной обработке растений. 1 табл.

Применение 6-меркаптопурина в качестве сенсибилизатора-интеркалятора.