СПОСОБ ОТБОРА ТРАНСФОРМАНТОВ ТОМАТА Российский патент 1995 года по МПК A01H1/04 A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано для селекции в условиях in vitro трансформантов, полученных при генетической трансформации растений посредством переноса плазмидной ДНК в растительную зиготу с помощью прорастающей пыльцы.

Трансфекция чужеродных генов в геном высших растений проводится на уровне целого растения, его органов, отдельных тканей, клеток (соматических и генеративных) и протопластов методами сокультивирования с агробактериями или прямым переносом ДНК в растительные клетки.

Известен способ отбора трансформантов, основанный на появлении в результате трансформации у рецессивного генотипа семян с доминантными признаками [1]
Известен также способ отбора трансформантов, в основе которого появление морфологически аномальных растений или опухолей, а также синтез специфических для агробактерий аминокислот [2]
Однако эти способы отбора не позволяют использовать селективные среды, что делает процесс отбора длительным и трудоемким.

Известен способ отбора трансформантов, заключающийся в том, что семена высевают на разбавленную вдвое питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую селективный агент антибиотик канамицин [4]
Однако этот способ не позволяет проводить отбор на ранних этапах развития растения зародышах. Кроме того, идентификация трансформантов согласно данному способу возможна лишь тогда, когда разовьются семядольные листья и произойдет утрата хлорофилла под действием канамицина, что требует значительных затрат времени. К тому же, необходимость дезинфекации семян перед посадкой на селективную среду снижает их всхожесть, что влияет на эффективность оценки трансформантов и создает возможность появления артефактов.

Задача изобретения ускорить процесс получения трансформантов и повысить эффективность отбора.

Поставленная задача решается следующим образом: посев эксплантата осуществляют на питательную среду, содержащую селективный агент канамицин, при этом в качестве эксплантата используют зародыши размером 2,0-2,5 мм, а посев осуществляют на питательную среду HLH [3]
Способ осуществляют следующим образом.

Цветки томата кастрируют и опыляют пыльцой, предварительно обработанной плазмидой, несущей в качестве селектирующего маркера ген устойчивости к антибиотику канамицину. Спустя 18-20 дней по достижению зародышами размера не менее 2,0-2,5 мм, что существенно для их дальнейшего развития нормального прорастания и развития в условиях in vitro, плоды срывают, дезинфицируют, извлекают зародыши и высевают на среду HLH, включающую канамицин в дозе 200 мг/л. Через 7 дней по отсутствию артефактов развития выявляют трансформированные зародыши.

П р и м е р. Исследования проводят на томатах сорта Факел. Цветки кастрируют и опыляют, как указано выше. Через 20 дней половину завязавшихся на растении плодов срывают, дезинфицируют, извлекают 2,0-2,5 мм зародыши и часть их высевают на селективную среду HLH, в состав которой вводят канамицин в количестве 200 мг/л. Данные взаимосвязи размеров зародышей с процентом их прорастания представлены в табл. 1. Вторую часть зародышей высевают на среду Мурасиге-Скуга, дополненную канамицином. Обоснование выбора среды HLH представлено в табл. 2.

Спустя семь дней по нормальному прорастанию и развитию зародышей, т.е. по отсутствию некрозов либо других аномалий развития на селективной среде HLH, выявляют среди них трансформанты. На селективной среде Мурасиге-Скуга зародыши не прорастают и не развиваются.

Для получения сравнительных данных вторую половину плодов сохраняют на растении до созревания семян, которое завершается на 42-43 день с момента опыления. Собранные семена дезинфицируют и высевают на селективную HLH среду с канамицином и на селективную среду Мурасиге-Скуга, также содержащую канамицин. Через 10-14 дней выявляют трансформанты по сохранению зеленой окраски семядольных листьев. Полученные данные представлены в табл. 3.

Основные отличия предлагаемого способа от прототипа представлены в табл. 4.

Из данных, представленных в табл. 1, видно, что максимальное прорастание зародышей наблюдается при размере зародыша не менее 2,0-2,5 мм, т.е. показатель размер зародыша является более точным и более информативным, чем возраст зародыша, поскольку при этом не наблюдается сортовой специфичности. Использование зародышей, больших чем 2,0-2,5 мм, т.е. более позднего возраста развития, не имеет смысла, поскольку задача способа ускорение процесса получения трансформантов.

Из данных табл. 2 видно, что среда HLH выбрана с учетом того, что содержит повышенное количество солей, витаминов и сахарозы, т.е. как наиболее оптимальная среда для нормального (без отклонений) прорастания и развития зародышей.

Из данных, представленных в табл. 3, видно, что использование питательной среды HLH с добавкой канамицина позволяет осуществить нормальное развитие только трансформированным, т. е. устойчивым к селектирующему агенту канамицину, зародышам.

Сопоставительный анализ заявленного решения с прототипом показывает, что заявленный способ отличается от известного тем, что в качестве эксплантата используют зародыши определенного размера 2,0-2,5 мм, а посадку эксплантата осуществляют на питательную среду HLH. Данные существенные отличия предлагаемого способа отбора трансформантов томата позволяют обеспечить по сравнению с известным следующие преимущества:
создается возможность выявить трансформанты на более ранних этапах развития растения (зародышах), что сокращает время оценки и ускоряет селекционный процесс;
зародыши по сравнению с семенами более чувствительны к действию селективного агента;
исключается возможность токсичного действия дезинфицирующих веществ на трансформанты, т.к. стерилизуют целый плод, стенки которого надежно защищают зародыши;
использование культуры изолированных зародышей позволяет полностью исследовать завязавшиеся зародыши (включая те, что не смогли по каким-либо причинам полностью созреть) в плодах и дает возможность тем самым увеличить выход трансформантов.

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекционно-генетические исследования, овощеводство. Сущность изобретения: трансформанты томата отбирают при выращивании зародышей размером 2,0 - 2,5 мм на канамицинсодержащей среде HLH. 4 табл.

СПОСОБ ОТБОРА ТРАНСФОРМАНТОВ ТОМАТА, включающий выращивание эксплантов на селективной питательной среде в присутствии канамицина, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют зародыши размером 2,0 2,5 мм, а в качестве питательной среды среду HLH.