СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАГРЕГАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК A61K31/44 A61K31/505 

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, и может быть использовано в качестве средства специфической профилактики тромбозов при различных патологических состояниях.

Наибольшее распространение в профилактике тромбозов нашли антиагрегаты, ингибирующие циклоксигеназу-аспирин, фосфодиэстеразу дипиридамол, кальций-блокаторы-верапамил (Ивлева А. Я. Балуда М. В. и др. Кардиология. 1988, N 5, с. 80-83).

Препараты дигидропиридонового ряда нашли широкое применение как средства, обладающие вазодилатирующим эффектом, понижающим АД. Препараты данного химического ряда проявляют выраженную биологическую активность в отношении гладкомышечных клеток, а также некоторых видов нервных волокон. (Р. Samuel. Pharm. industry. 1992.).

Лекарственные средства, обладающие антиагрегантной активностью, подвергаются к интенсивному исследованию.

Установлено, что препарат 2,6-диметил-3,5-бис/2-этоксикарбонил-4/2''-дифлуорометоксифенил/-1,4-дигидро пирин- по классификации Института Синтеза АН Латвии ИОС-1212 проявляет выраженный антиагрегатный эффект в отношении тромбоцитов. Препарат впервые синтезирован в Институте Органического Синтеза АН Латвии в 1990 году. По физическим свойствам представляет собой белое кристаллическое вещество, растворимое в воде, М. В. 427,8.

Эксперименты приведены на белых нелинейных крысах-самцах массой 220-250 г. По истечении послеоперационного периода после катетеризации брюшной аорты (2,5± ±0,3 сут) кровь забиралась у бодрствующих крыс силиконированным шприцем через катетер и стабилизировалась 130 мМ раствором цитрата натрия. Богатую тромбоцитами плазму получали центрифугированием крови при 100G в течение 10 мин. После удаления супеpнатанта для получения плазмы, бедной тробмоцитами, кровь подвергалась дальнейшему центрифугированию в течение 20 мин при 300G. Агрегацию тромбоцитов определяли методом, основанным по статистическом анализе флуктуаций светопропускания, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале. Метод отличается высокой чувствительностью, что делает пригодным его для исследования спонтанной агрегации, агрегации под действием низких концентраций индукторов, что является наиболее оптимальным для клинического и лабораторного исследования.

В качестве индукторов агрегации использовали АДФ в концентрациях 0, 1, 0, 5 и 1 мкМ, арахидоновую кислоту в концентрациях 6, 5, 12, 5 и 25 мМ и фактор активации тромбоцитов (ФАТ) в конечных концентрациях 10, 20, и 30 нМ. В качестве растворителя АДФ использовали изотонический раствор натрия хлорида, ФАТ и арахидоновую кислоту готовили на этаноле. Для оценки процесса агрегации определяли следующие показатели: степень агрегации М, максимальную и начальную скорости агрегации V и V_maх, время агрегации Т, глубину и вторую волну агрегации при их наличии.

Эксперименты включали несколько серий: серия опытов in vitro влияние препаратов на процесс индуцированной агрегации при различных временных экспозициях препаратов (1, 3 и 5 мин) влияние препаратов на процесс индуцированной развившейся агрегации при различных временных интервалах (10, 30, 60 и 120 с от начала агрегации) влияние препаратов на процесс спонтанной агрегации при различных временных интервалах инкубации с ними (1, 3 и 5 мин) влияние растворителя на исследуемые процессы спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов. Серия опытов ex vivo влияние препаратов на процесс индуцированной агрегации после применения их в дозе 0,3 мг/кг влияние препаратов на процесс спонтанной агрегации после применения его в/в в суточной дозе 0,3 мг/кг влияние растворителя на исследуемые процессы спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов. Исследуемые препараты применялись в экспериментах in vitro в концентрациях 10^-5-10^-7 М в соответствии с рекомендациями Института Органического Синтеза АН Латвии (Р. О. Витолиня Известия АН Латвийской ССР, 1987, N 6, с, 71). Расчет эффективности проводился с использованием четырехпольной таблицы и точного критерия Фишера. (В. С. Генес. Таблицы достоверных различий между группами наблюдений по качественным показателям. 1964, В. Ю. Урбах. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. 1975). Расчет ЭД-50 проводили методом пробит-анализа по Ч. Блиесу (М. Л. Беленький. Элементы качественной оценки фармакологического эффекта. 1963). Каждая группа включала 10 наблюдений.

Были проведены сравнительные аналогичные по протоколу исследования с применением ингибитора кальциевых каналов нифедипина и нимодипина, синтезированных в Институте Органического Синтеза АН Латвии.

Выбор препаратов сделан по подобию химического строения веществ.

В результате проведенных экспериментов отмечен статистически достоверный выраженный антиагрегатный эффект всех исследуемых препаратов. Нифедипин ингибировал агрегацию тромбоцитов, вызванную всеми применяемыми индукторами в среднем на 21,3± 1,2% в то время как исследуемый препарат дигидропиридинового ряда достоверно ингибировал агрегационное действие АДФ на 31 + 0,7% а ФАТ на 33 + 1,1% агрегационное действие АДФ на 31 ± 0,7% а ФАТ на 33 ± 1,1% Влияние нимодипина проявлялось только начиная с концентрации 10^-5 М. Нимодипин тормозил эффект АДФ на 20 ± 1,6% а арахидоновой кислоты на 23 ± 1,2% Проведя анализ только значений степени агрегации приходим к выводу о ряде антиагрегантной активности среди исследуемых препаратов: препарат ИОС-1212, нифедипин, нимодипин.

В табл. 1 представлены результаты исследования влияния лекарственных препаратов на показатели процесса агрегации в сериях опыта in vitro. Эксперименты в условиях еx vivo подтверждают заключение об активности препаратов. Препарат ИОС-1212 в суточной дозе спонтанную агрегацию тромбоцитов на 34 + 1,4% в то время как нифедипин и нимодипин, сходные по химическому строению и составу, тормозили спонтанную агрегацию тромбоцитов на 22 ± 1,3% в то время как препарат, обладающий антагонизмом к ионам Са, в аналогичных условиях эксперимента ингибировал агрегацию в сравнении с контролем на 20 ± 3,2%
В табл. 2 представлены результаты влияния лекарственных препаратов на процесс агрегации тромбоцитов в условиях опыта ех vivo при ЭД-50 0,3 мг/кг в/в. Следующая серия опытов проводилась в условиях in vitro на богатой тромбоцитами плазме относительно здоровых доноров в возрастной группе от 30 до 44 лет. Кровь забиралась из кубитальной вены натощак силиконированными инструментами. Кровь подготавливалась к исследованию процесса агрегации аналогичным способом, что и кровь в экспериментах на животных, согласно рекомендациям КНЦ АН РФ/1980 г. (Сравнительный анализ влияния исследуемых препаратов на процесс агрегации тромбоцитов человека проводился согласно предыдущему протоколу).

В табл. 3 представлены результаты влияния лекарственных препаратов на процесс агрегации тромбоцитов у относительно здоровых доноров in vitro.

П р и м е р 1. Белая крыса-самец массой 230 г. Продолжительность послеоперационного периода после катетеризации брюшной аорты 2,6 сут, нормальное его течение. Показатели процесса агрегации тромбоцитов in vitro:
М V V_max лаг- T
период ИОС-1212 10,5 0,65 1,45 0,95 2,56
нифе- дипин 15,43 1,79 1,43 1,61 2,49
нимо- дипин 19,06 1,85 2,17 2,35 3,76 ex vivo ИОС-1212 12,07 1,06 0,96 0,97 2,55 нифе- дипин 17,52 0,73 1,21 1,62 3,52 нимо- дипин 19,17 0,81 2,53 1,16 2,54
П р и м е р 2. Белая крыса-самец массой 250 г. Продолжительность послеоперационного периода 2,5 сут после катетеризации брюшной аорты, нормальное его течение. Показатели процесса агрегации тромбоцитов при действии лекарственных препаратов in vitro 0,66 0,95 0,95 2,45-ИОС-1212 нифе- дипин 14,56 0,59 1,29 1,73 2,39 нимо- дипин 17,64 0,96 1,33 1,16 2,82 ех vivo ИОС-1212 9,85 0,74 1,7 1,75 3,21 нифе- дипин 15,03 1,19 1,67 1,79 3,17 нимо- дипин 19,03 1,51 1,92 1,83 3,22
П р и м е р 3. Г-н Д. 34 лет. Жалоб не предъявляет, при объективном осмотре и исследованиях патологии внутренних органов не выявлено. Показатели процесса агрегации тромбоцитов при действии лекарственных препаратов in vitro: ИОС-1212 10,50 0,98 1,15 1,76 3,12 нифе- дипин 17,21 0,89 1,25 1,84 3,17 нимо- дипин 20,37 1,49 1,49 1,78 3,72
П р и м е р 4. Г-н А. 40 лет. Жалоб не предъявляет, при объективном осмотре и исследованиях патологии внутренних органов не выявлено. Показатели процесса агрегации тромбоцитов при действии лекарственных препаратов in vitro: ИОС-1212 10,63 0,96 1,09 1,74 3,22 нифе- дипин 16,91 0,86 1,27 1,79 3,43 нимо- дипин 20,32 1,49 1,86 1,79 3,71
Резюмируя полученные данные необходимо отметить, что препарат дигидропиридина-ИОС-1212 проявляет выраженный антиагрегантный эффект в отношении тромбоцитов даже в присутствии малых концентраций индукторов агрегации и при действии на спонтанную агрегацию тромбоцитов в низких концентрациях препарата, что подчеркивает его превосходство в сравнении с применяемым ингибитором фосфодиэстеразы дипиридамолом, в качестве антиагрегантного средства.

Наиболее эффективной концентрацией по влиянию на ингибирование процесса агрегации тромбоцитов была 10^-5 М.

В сравнительном анализе исследуемых препаратов необходимо отметить, что при применении аспирина в качестве антитромботического средства следует учитывать, что одновременно с торможением биосинтеза тромбоксана ингибируется биосинтез другого производного арахидоновой кислоты простациклина. Данный эффект не отмечен при исследовании действия дигидропиридина ИОС-1212. Антиагрегантный эффект дипиридамола значительно слабее выявленного у препарата ИОС-1212, что создает дополнительные возможности для использования более активного препарата и разработок в синтезе новых эффективных антиагрегантных средств этой химической группы.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что 2,6-диметил-3,5-бис/2-этиксикарбонил/-1,4-диг-идропиридин ИОС-1212 проявляет выраженные антиагрегантные свойства.

Антиагрегатный эффект в отношении тромбоцитов превышает эффект применяемых традиционных средств (дипиридамола, индобуфена).

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, и может быть использовано в качестве средства профилактики тромбозов при различных патологических состояниях. Впервые установлено, что вещество, имеющее химическую формулу обладает антиагрегантной активностью в отношении тромбоцитов. 3 табл.

Применение 2,6-диметил-3,5-бис- (2-этоксикарбонил-4) 2″ -дифлуорометоксифенил-1,4- дигидропиридина в качестве средства, обладающего антиагрегантной активностью.