НИТРОЭФИР ОКИСЛЕННОГО КРАХМАЛА НАТРИЕВОЙ СОЛИ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИАГРЕГАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1997 года по МПК C08B31/18 

Изобретение относится к биологически активным соединениям, находящим применение в медицине в качестве антиагрегантных средств.

Известно антиагрегационное средство 2,6-бис-[бис-β-оксиэтил-амино-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-a)- пиримидин (дипиридамол, курантил), стимулирующее биосинтез простациклинаа и ингибирующее синтез тромбоксанов [1]
Недостатком известного средства является ограниченное антиагрегантное действие. Это выражается в том, что дипиридамол, например, не тормозит агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином [2]
В связи с этим в клинической практике дипиридамол приходится сочетать с аспирином, окислами азота и др. [3]
Известен препарат сульфинпиразон (антуран), который является конкурентным антагонистом арахидоновой кислоты, вызывающей агрегацию тромбоцитов. Этот препарат тормозит агрегацию тромбоцитов, в ответ на действие коллагена, но не тормозит агрегацию, вызванную тромбином. Максимальный антиагрегационный эффект достигается лишь через 6 мес приема [4]
Известно антиагрегационное средство ацетилсалициловася кислота - аспирин, оказывающее ингибирующее влияние на спонтанную и индуцированную агрегацию тромбоцитов. Так же, как и антуран, аспирин является конкурентным антагонистом арахидоновой кислоты, не оказывая влияния на агрегацию, вызванную другими индукторами (например, тромбином), что ограничивает его применение.

Кроме этого, недостатком аспирина (ацетилсалициловася кислота ASA) является снижение антиагрегантной активности при увеличении дозы, что связано со снижением синтеза простациклинов в стенке сосудов. Это относится к отрицательным свойствам ацетилсалициловой кислоты [5]
Известные антиагреганты имеют ограниченный спектр действия.

Так как процесс агрегации тромбоцитов в организме может протекать с участием различных механизмов, то необходимо оценить действие заявляемого соединения на агрегацию, вызванную различными индукторами аденазиндифосфат (АДФ), тромбин, ристомицин, арахидоновая кислота) [6 и 7]
Цель изобретения создание вещества (соединения), обладающего антиагрегантным действием в отношении АДФ, тромбин-, ристомицин - индуцированной агрегации и агрегации, индуцированной арахидоновой кислотой.

Цель достигается структурой нитроэфираа окисленного крахмала натриевой соли формулы
,
где k+m+n СП степень полимеризации;
СП 10 100;
m 6 47; n 2 34; K 0 29
с молекулярной массой 2088 20352.

Среди производных окисленного крахмала известна его натриевая соль, проявляющая антиаритмическое действие [8] Достоверно установленным антиагрегантным действием натриевая соль окисленного крахмала не обладает.

Предлагаемое соединение обладает выраженным антиагрегационным широкого спектра действием, чем известные, применяемые в профилактической и клинической медицине аналоги, например аспирин.

Предлагаемое соединение получают следующим образом: 20 г крахмала окисляют 7 20-ным раствором N₂O₄ в CCl₄ течение 24 ч при комнатной температуре. Окисленный крахмал отмывают дистиллированной водой до исчезновения в промывных водах NO₂ ^- и NO₃ ионов (реакция с дифениламином), отфильтровывают на воронке Бюхнера, сушат на воздухе до воздушно-влажного состояния, определяют содержание карбоксильных групп барий-ацетатным методом, для чего точную навеску окисленного крахмала (≈0,2 г) заливают 40 мл 0,2 н раствора ацетата бария, выдерживают 2 ч, после чего аликвоту (10 мл раствора) титруют 0,05 н. раствором NaOH. Содержание карбоксильных групп рассчитывают по формуле
,
где V и N объем и концентрация раствора NaOH
g навеска окисленного крахмала.

20 г окисленного крахмала помещают в нитрующую смесь, содержащую 49 70 мас. HNO₃, 25 50 H₃PO₄ и 1 5 P₂O₅, выдерживают 10 60 мин при комнатной температуре, отфильтровывают на фильтре Шотта, промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе до воздушно-влажного состояния. В полученном образце определяют содержание нитроэфирного азота методом Кьельдаля.

В полученных образцах определяют содержание карбоксильных групп C_COOH(р), для чего точную навеску образца заливают 40 мл 0,2 н. раствора ацетата бария и все последующие операции проводят как в случае определения C_COOH(исх).

15 г нитроэфираа окисленного крахмала растворяют в 60 мл водного раствора, содержащего 1,7 2,8 гидроксида натрия, доводят рН раствора до физиологического, после чего осаждают Na-соль нитроэфира окисленного крахмала ацетоном или изопропанолом.

Молекулярную массу Na-соли нитроэфира окисленного крахмала определяют методом гель-хроматографии. В качестве калибрантов используют декстран с различной молекулярной массой.

По результатам анализа рассчитывают значения m, n и k по следующим формулам

В связи с тем, что последовательность всех операций по получению Na-соли нитроэфира окисленного крахмала одинакова, все данные по условиям получения и анализу заявленного соединения представлены в табл. 1.

Анализ ИК-спектров образцов нитрованного окисленного крахмала показывает наличие интенсивных полос поглощения 840 см^-1 валентных колебаний , 1280 см^-1 симметричных валентных колебаний нитратных групп, 1660 см^-1 валентных колебаний двойных связей N O, что однозначно указывает на то, что определяемый азот в этих образцах находится в виде нитроэфирных групп. Полоса поглощения 1660 см^-1, присутствующая на ИК-спектре окисленного крахмала, может быть отнесена к присутствующей в нем воде. Нитрование окисленного крахмала в используемых нами условиях незначительно разрушает систему водородных связей окисленного крахмала, о чем свидетельствует отсутствие существенных различий в области 3100 3700 (см. ИК-спектры этих образцов).

Исследование влияния предлагаемых соединений на агрегацию тромбоцитов in vitro проводилось с применением установки с гелий-неоновым лазером в качестве источника света [6 и 7]
Работа с тромбоцитами проводилась с использованием Ca²⁺ - содержащего буфера при температуре 37^oC при постоянном перемешивании. Использовалась плазма, обогащенная тромбоцитами, а также отмытые тромбоциты [8] Количество тромбоцитов составляло обычно (3 4)•10⁷ клеток/мл.

Вначале регистрировался исходный уровень интенсивности света, прошедшего через клеточную суспензию неактивированных тромбоцитов. После внесения агрегата регистрировалась кинетика изменения светопропускания клеточной суспензии в ответ на действие индуктора агрегации.

Антиагрегационное действие соединений нитроэфира окисленного крахмала натриевой соли излучалось с различными индукторами агрегации: аденозиндифосфатом (АДФ) (Reanal, ВНР), ристомицином (мосмедпрепарат), тромбином (Sigma, США), арахидоновая кислота (Merck, США).

Исследуемые вещества вносили в суспензию тромбоцитов и преинкубировали в течение 3 мин при 37^oC, т. е. определяли их предупреждающее действие. Ингибирование агрегации оценивали по изменению скорости агрегации относительно контроля (У/У_о), где У_о скорость агрегации тромбоцитов под влиянием индуктора; У скорость агрегации тромбоцитов после внесения изучаемых соединений с последующим введением индуктора.

Действие индуктора без добавления антиагреганта принимали за 1.

Было проведено сравнительное изучение эффективности ингибирующего действия аспирина. В качестве препарата сравнения (прототип) был взят аспирин (Bayer, ФРГ), так как по структуре он ближе других препаратов к нитроэфиру окисленного крахмала натриевой соли: оба содержат карбоксильную группу. Кроме того, это один из препаратов, наиболее часто используемых в практической медицине для антиагрегационной терапии [9 и 10]
Пример 1. Все используемые соединения из табл. 1 (нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли с различным содержанием нитроэфирных групп), добавленные к обогащенной тромбоцитами плазме за 3 минуты до начала агрегации, вызванной АДФ (2,5•10^-5 M), значительно снижали агрегационную способность тромбоцитов.

Результаты ингибирующего действия указанных соединений на АДФ-агрегацию, представлены в табл. 2.

Из приведенных данных видно, что предлагаемые соединения содержащие 15 - 16 карбоксильных групп и 3 4 нитроэфирных групп на модели АДФ-индуцированной агрегации оказывают выраженное антиагрегационное действие, достоверно превосходящее действие аспирина. Дальнейшее увеличение количества карбоксильных групп, не приводит к увеличению ингибирующего действия на агрегацию тромбоцитов (по данным табл. 2). Максимально возможное количество нитроэфирных групп, введенное в процессе нитрации, составляет 4,76
Наибольшей активностью обладает соединение N 14 из табл. 1, которое уже в дозе 10 мг/мл полностью подавляет агрегацию тромбоцитов, вызываемую АДФ.

В связи с этим все последующие эксперименты выполнялись с использованием соединения данного состава.

Пример 2. Для дальнейшего излучения был взят нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли с содержанием карбоксильных групп 16,01 и нитроэфирных групп 3,96 как наиболее активная на вышеописанной модели агрегации тромбоцитов. Изучаемое соединение, добавленное к обогащенной тромбоцитами плазме за 3 мин до начала агрегации, вызванной ристомицином (20 мг/мл), вызывает значительное снижение агрегации тромбоцитов. В табл. 3 представлены результаты ингибирующего действия соединения на ристомицин-индуцированную агрегацию.

Чрезвычайно важным представляется купирующий эффект изучаемых соединений, содержащих нитроэфирные группы: ристомициндуцированную агрегацию они прерывают на любой стадии.

Пример 3. Исследуемое соединение (нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли содержанием карбоксильных групп 16,01 и нитроэфирных групп 3,96 ), добавленное к суспензии отмытых тромбоцитов за 3 минуты до начала агрегации под действием тромбина (1 мг/мл), вызывает значительное снижение агрегации тромбоцитов. В табл. 4 представлены результаты ингибирующего действия этого соединения на тромбининдуцированную агрегацию.

Пример 4. Исследуемое соединение (нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли с содержанием карбоксильных групп 16,01 и нитроэфирных групп 3,96), добавленное к обогащенной тромбоцитами плазме за 3 мин до начала агрегации, вызванной арахидоновой кислотой (10 мг/мл) снижало агрегацию тромбоцитов. В табл. 5 представлены результаты ингибирующего действия на агрегацию тромбоцитов, вызванную арахидоновой кислотой.

Из приведенных в табл. 2 5 данных следует, что нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли, содержащий 15 16 карбоксильных групп и 3 4 нитроэфирных групп, обладает выраженным ингибирующим действием на АДФ-индуцированную агрегацию. Доза заявляемого соединения, необходимая для достижения максимального эффекта, в 2 раза меньше, чем аспирина. Для ингибирования агрегации, вызванной ристомицином, максимально эффективная доза аспирина превышает эффективную дозу заявляемого соединения в 12,5 раз. Кроме того, предлагаемые соединения обладают купирующим действием в отношении ристомицин-индуцированной агрегации. Аспирин этой способностью не обладает.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что предлагаемые соединения в 10 раз эффективнее аспирина при тромбин-индуцированной агрегации.

Максимальный ингибирующий эффект в отношении арахидоновой кислоты предлагаемое соединение проявляет в дозе 10 мг/мл, однако, он не превосходит аналогичного действия аспирина.

Таким образом, экспериментально установлено, что нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли имеет существенный антиагрегантный эффект широкого спектра, который достигает максимальной величины при содержании карбоксильных групп 15 16 и нитроэфирных групп 3 4 и по антиагрегантному действию на АДФ, тромбин, ристомицин превосходит такой широко применяемый в медицинской практике антиагрегант как аспирин.

Предлагаемое соединение может быть использовано для предупреждения и лечения тромбоэмболических осложнений.

В табл. 2 5 представлены средние значения 3 5 независимых экспериментов. Порядковые номера соединения соответствуют номерам, использованным для обозначения аналогичных соединений в табл. 1.

Использование: в медицине в качестве антиагрегатного средства. Сущность изобретения: нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли формулы:

где k+m+n = СП - степень полимеризации СП = 10 - 100; m = 6 - 46; n = 2 - 34; k = 0 - 29, с молекулярной массой 2088 - 20352. 5 табл.

Нитроэфир окисленного крахмала натриевой соли формулы

где CП 10 1000;
m 6 47;
n 2 34;
k 0 29;
m + n + k CП степень полимеризации,
с мол. м. 2088 20352, обладающий антиагрегантным действием.