2-(1S,2R,5S)-6,6-ДИМЕТИЛБИЦИКЛО[3.1.1]ГЕПТ-2ИЛ]МЕТИЛ}СУЛЬФИНИЛ)ЭТАНОВАЯ КИСЛОТА, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИАГРЕГАЦИОННЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2014 года по МПК C07C317/44 A61K31/10 A61K31/19 A61P7/02 

Изобретение относится к химии серосодержащих и терпеновых соединений, а именно к терпенсульфоксиду формулы I, который может быть использован в медицинской практике в качестве средства, обладающего антиагрегационным действием, для консервации препаратов крови и профилактики тромбозов.

Известны средства, обладающие антиагрегационным действием (2-ЦИКЛОАЛКИЛ-АМИНО-5-ТИЕНИЛ-1,3,4-ТИАДИАЗИНЫ ГИДРОБРОМИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИАГРЕГАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ / Чупахин О.Н. [и др.]; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский государственный технический университет - УПИ"; заявл. 2008130297/04, 22.07.2008; опубл. 20.01.2010), (Пат. 2039558 РФ, A61K 31/44, A61K 31/505. СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАГРЕГАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ / Киричук В.Ф. [и др.]; заявитель и патентообладатель Саратовский государственный медицинский институт - №93035343/14, заявл. 07.07.1993, опубл. 20.07.1995), (Пат. 2186782 РФ, C07J 53/00, C07J 63/00, C07D 271/08, C07D 271/12, A61K 31/50, A61K 31/4245, A61K 31/56. КОМПЛЕКСЫ ВКЛЮЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,2,5-ОКСАДИАЗОЛ-2-ОКСИДА С ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ГЛЮКОПИРАНОЗЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ / Хропов Ю.В. [и др.]; заявитель и патентообладатель Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова - №2001101367/04, заявл. 16.01.2001, опубл. 10.08.2002), (Пат. 2189241 РФ, A61K 35/78. СРЕДСТВО "ПАТРИМИН", ОБЛАДАЮЩЕЕ СЕДАТИВНЫМ, ГИПОТЕНЗИВНЫМ, АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ, АНТИАГРЕГАЦИОННЫМ И ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ / Колхир В.К. [и др.]; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество "Простанорм" - №2001117333/14, заявл. 2001.06.26, опубл. 2002.09.20).

В ходе многолетних исследований было установлено, что основным фактором, запускающим процесс свертывания крови, является изменение структуры клеточных мембран, контактирующих с кровью (Взаимодействие фактора X человека с тканевым тромбопластином / Киселев С.В., Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н. // Биомедицинская химия. - 2003, - Т.49, - №5, - С.443-450; Значение структуры клеточных мембран в инициировании свертывания крови // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. - Изд-во КГМУ, - 2005, - 41 стр.). Эти изменения индуцируются различными физиологическими и патологическими агентами, приводящими к нарушению асимметричности клеточной мембраны, появлению мезоморфных структур и активации специфических рецепторов. Поэтому поиск веществ, способствующих воздействию на эти процессы и позволяющих их корректировать, является основной задачей создания принципиально новых лекарственных препаратов. Модификация природных терпенов путем введения серосодержащих биологически активных фрагментов с последующим окислением сульфидной функции позволяет получить антиагрегационное средство нового типа.

Известны структурные аналоги заявляемого соединения: метил({[1S,2R,5S,R_S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)ацетат и 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметил-бицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этанол (Синтез и противогрибковая активность сульфидов, сульфоксидов, сульфонов на основе β-пинена / Никитина Л.Е. [и др.] // ХФЖ, - Т.44, - №3, - 2010, - С.17-20).

Цель изобретения - новое эффективное соединение, обладающее антиагрегационным действием, и способ его получения.

Поставленная цель достигается предлагаемым изобретением, а именно 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислотой (формулы I), обладающей антиагрегационным действием. Способ получения 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло [3.1.1] гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоты заключается в окислении терпенсульфида 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}тио)этановой кислоты перекисью водорода в ледяной уксусной кислоте. 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-Диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}тио)этановая кислота предварительно получена по известной методике в реакции (-)-β-пинена с меркаптоуксусной кислотой (Синтез и противогрибковая активность сульфидов, сульфоксидов, сульфонов на основе β-пинена / Никитина Л.Е. [и др.] // ХФЖ, - Т.44, - №3, - 2010, - С.17-20).

Заявляемое соединение - 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановая кислота является новым соединением и его свойства в литературе не описаны.

Пример конкретного выполнения.

Способ получения соединения 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоты заключается в окислении терпенсульфида - 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}тио)этановой кислоты 27%-ной перекисью водорода в ледяной уксусной кислоте при перемешивании в течение 38 часов, при постепенном повышении температуры от 5°C до комнатной.

К охлажденному до 5°C раствору 0.4 г (20 ммоль) 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}тио)этановой кислоты в 15 мл ледяной уксусной кислоты прикапывали при перемешивании 0.4 мл (40 ммоль) перекиси водорода (27%). Реакционную смесь перемешивали 38 ч (ТСХ контроль) при комнатной температуре, затем выливали в воду, экстрагировали эфиром. Эфирный экстракт промывали насыщенным раствором K₂CO₃, водой до нейтральной реакции, из воды экстрагировали эфиром. Органический слой сушили MgSO₄. После отгонки растворителя продукт выделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле (элюент - ацетон). Получили 62% продукта - 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил]сульфинил) этановой кислоты в виде порошка белого цвета (t_пл.=88°С).

Спектр ЯМР ¹Н (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 1,10 с. (3Н, Н-9); 1,30 с. (3Н, Н-8); 1,29-1,31 м. (1Н, Н-7); 1,62-1,69 м. (1Н, Н-3); 1,92-2,39 м. (5Н, Н-1, Н-2, Н-3, 2Н-4); 2,41-2,48 (м, 1Н, Н-7); 2,62-2,72 (м, 1Н, Н-5); 2,80-3,10 (м, 2Н, Н-10); 4,20-4,30 (м, 2Н, SOCH ₂).

Элементный анализ: Найдено, %: С - 60.7; Н - 6.3; О - 20.5; S - 13.4. C₁₂H₂₂O₃S. Вычислено, %: С - 60.2; Н - 6.3; О - 20.1; S - 13.3.

Нами установлена антиагрегационная активность 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметил-бицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоты, позволяющая использовать ее для консервации препаратов крови и профилактики тромбозов.

Возможность использования полученного вещества для коррекции гемостаза определяли in vitro на плазме крови человека. Венозную кровь забирали в пластиковую центрифужную пробирку объемом более 10 мл с раствором антикоагулянта (130 мМ цитрата натрия). Кровь стабилизировали раствором цитрата натрия в отношении 1:9 и медленно перемешивали. Затем центрифугировали при 1400 об/мин в течение 10 минут для получения богатой тромбоцитами плазмы. После отбора 2,5 мл супернатанта оставшуюся кровь центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения бедной тромбоцитами плазмы, которая использовалась для разведения богатой тромбоцитами плазмы до фиксированной объемной концентрации тромбоцитов и определения коагуляционного гемостаза.

Для оценки системы гемостаза использовали определение скорости агрегации тромбоцитов и поверхностно-зависимые стандартные коагуляционные тесты: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое и тромбиновое время с расчетом Международного Нормализованного Отношения (MHO). Агрегационную активность тромбоцитов устанавливали с помощью анализатора «Chrono-Log Corporation)) (США) по методу G. Born. Для этого в кювету прибора помещали 250 мкл богатой тромбоцитами плазмы. Оптическим контролем служил такой же объем плазмы, не содержащей тромбоцитов. О степени агрегации судили по максимальной величине падения оптической плотности после окончания реакции по сравнению с исходной величиной. Коагуляционную активность определяли на коагулометре «Минилаб-7001» (Россия).

Для определения спонтанной агрегации тромбоцитов и коагуляционной активности плазмы использовалась венозная кровь больных с ишемической болезнью сердца (ИБС), а индуцированная агрегация тромбоцитов исследовалась на плазме, полученной от здоровых доноров. С этой целью к 0,45 мл плазмы добавляли 0,05 мл раствора, содержащего 17 мМ препарата в 8% растворе этилового спирта, и инкубировали полученную смесь в течение 5 мин при температуре 37°C. В контрольных опытах к плазме добавляли растворитель, используемый для приготовления препарата (8% раствор этилового спирта). Для индукции агрегации тромбоцитов применяли растворы: АДФ (5 мкМ), адреналина (10 мкМ), коллагена (2 мкг/мл), арахидоновой кислоты (0.5 мМ) и ристомицина (1 мг/мл).

Результаты исследования обработаны с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel. Статистический анализ данных включал оценку достоверности отличий сравниваемых величин по t-критерию Стьюдента (p<0,05).

Из результатов следует, что полученное вещество обладает высокой избирательной антиагрегационной активностью: полностью подавляет спонтанную агрегацию тромбоцитов (табл.1) и агрегацию, индуцированную арахидоновой кислотой (табл.2), а также значительно (в 6,5 раз) снижает агрегацию, вызванную коллагеном (табл.2). Кроме того, снижается и коагуляционная активность плазмы: нормализуется АЧТВ. увеличивается протромбиновое время и MHO (табл.1). Однако при этом наше соединение не сказывалось на активности тромбина (тромбиновое время не изменяется). Это означает, что полученное вещество ингибирует активацию коагуляционных факторов и не влияет на их ферментативную активность.

Таблица 1 Влияние 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоты на агрегацию тромбоцитов и показатели коагуляционного гемостаза in vitro у пациентов с ИБС Показатели системы гемостаза Плазма без препарата, n=31 Плазма с препаратом, n=31 P Спонтанная скорость агрегации (отн. ед./мин) 0,718±0,587 0,042±0,0091 <0,001 Нормальный показатель не более 0,05 P <0,001 >0,05   Степень агрегации (ед.) 3,32±0,87 1,29±0,24 <0,001 Нормальный показатель не более 1,35 P <0,001 >0,05   АЧТВ (с) 25,83±2,21 30,6±1,51 <0,01 Нормальный показатель 32,7±3,11 P <0,01 >0,05   Протром. время (с) 19,02±2,11 24,8±1,81 <0,01 Нормальный показатель 12,8±2,11   <0,01 <0,01   Протромбиновый индекс (%) 76,38±8,91 56,92±7,58 <0,001 Нормальный показатель 85-100%   >0,05 <0,001   MHO 1,22±0,14 1,54±0,11 <0,01 Нормальный показатель 1,1±0,09 P >0,05 <0,001   Тромбиновое время (с) 15,1±0,98 15,3±0,66 >0,05 Нормальный показатель 14,6±0,79 P >0,05 >0,05  

Таблица 2 Влияние 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил) этановой кислоты на индуцированную in vitro агрегацию тромбоцитов   Плазма без препарата, n=29 Плазма с препаратом, n=29 Р Индуцирование АДФ (%) 54,41±1,56 49,33±1,31 <0,01 Нормальный показатель 50-75% P >0,05 >0,05   Индуцирование адреналином (%) 66,5±2,50 40,33±7,31 <0,001 Нормальный показатель 60-71% P >0,05 <0,001   Индуцирование арахидоновой к-той (%) 65,5±3,50 1,2±0,9 <0,001 Нормальный показатель 62-69% P >0,05 <0,001   Индуцирование коллагеном (%) 63,33±10,21 9,8±4,1 <0,001 Нормальный показатель 50-75% P >0,05 <0,001   Индуцирование ристомицином (%) 66,66±6,31 70,66±1,32 >0,05 Нормальный показатель 50-75% Р >0,05 >0,05  

Предлагаемое вещество по химической природе не имеет аналогов среди антиагрегационных препаратов. Поэтому в качестве препарата сравнения выбрали ацетилсалициловую кислоту и клопидогрель (плавике) как наиболее эффективные антиагрегационные препараты, используемые в настоящее время в клинической практике. В таблице 3 приведены результаты индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии препаратов.

Таблица 3 Сравнительная характеристика 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.11 гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоты, и клопидогреля Препарат Ацетилсалициловая кислота, n=19 P Предлагаемое соединение, n=21 P Клопидогрель. n=17 Место приложения in vivo, блокада простагландин-Н-синтетазы в тромбоцитах и мегакариоцитах   in vitro, антагонист коллагеновых рецепторов тромбоцитов   Пролекарство, in vivo, антагонист АДФ-рецепторов тромбоцитов Индуцирование АДФ (%) 46,3±9,1 >0,05 49,33±1,31 <0,01 35,1±3,2 Нормальный показатель 50-75% P >0,05   >0,05   <0,001 Индуцирование адреналином (%) 36,3±3,1 >0,05 33,7±2,1 <0,01 51,3±0,7 Нормальный показатель 50-68% P <0,01   <0,01   >0,05 Индуцирование арахидоновой к-той (%) 24,6±2,4 <0,01 1,1±0,9 <0,01 64,6±2,8 Нормальный показатель 60-75% Р <0,01   <0,01   >0,05 Индуцирование коллагеном (%) 38,4±14,6 <0,01 9,8±4,1 <0,01 33,1±10,7 Нормальный показатель 50-75% P >0,05   <0,001   <0,01 Идуцирование ристомицином (%) 48,2±19,1 >0,05 70,66±1,32 <0,01 56,4±9,8 Нормальный показатель 50-75% P >0,05   >0,05   >0,05

В случае АДФ-индуцированной агрегации наше соединение обладает одинаковым антиагрегационным эффектом с ацетилсалициловой кислотой, но уступает в 1,4 раза клопидогрелю. При коллагеновой и арахидоновой активации тромбоцитов предлагаемое вещество обладает более значимым эффектом, как в сравнении с ацетилсалициловой кислотой (3,9 раз), так и с клопидогрелем (3,4 раза). Таким образом, из представленного исследования следует, что особенностью предлагаемого нами соединения является его способность избирательно блокировать агрегацию тромбоцитов, вызываемую коллагеном, который, как известно, является более сильным индуктором, чем АДФ.

Коллаген-индуцированная активация тромбоцитов осуществляется в основном через их Р2Х1 рецепторы. При этом активируются мембраносвязанные ферменты фосфолипазы А2 и С, что приводит к высвобождению из фосфолипидов арахидоновой кислоты. Арахидоновая кислота под действием фермента циклооксигеназы превращается в простагландины G2 и H2, которые ингибируют активность этого фермента и приводят к образованию тромбоксана А2. Тромбоксан A2 является ионофором для ионов кальция и вызывает увеличение их внутриклеточной концентрации. Эти процессы вызывают изменение структуры клеточной мембраны тромбоцитов, и они приобретают как способность к адгезии и агрегации, так и тромбогенные свойства, что, в свою очередь, приводит к активации плазменного гемостаза. Известно, что коллаген является более сильным индуктором, чем АДФ. Поэтому полученное соединение может оказаться весьма перспективным для разработки принципиально новых препаратов, используемых для профилактики тромбофилии.

Учитывая способность 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоты полностью подавлять спонтанную активацию тромбоцитов и низкую токсичность серосодержащих терпенов (Синтез и противогрибковая активность соединений пинанового ряда / Никитина Л.Е. [и др.] // ХФЖ, - 2009, - Т.43, - Вып.5, - С.20-23), полученное вещество может быть использовано в качестве стабилизатора препаратов крови.

Изобретение относится к химии серосодержащих и терпеновых соединений, а именно к 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановой кислоте структурной формулы I:

Технический результат: получено новое соединение, которое может быть использовано в медицине в качестве средства, обладающего антиагрегационным действием, для консервации препаратов крови и профилактики тромбозов. 2-({[(1S,2R,5S)-6,6-Диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановая кислота также может быть использована в медицинской практике в качестве средства для профилактики гемофилии. 3 табл.

2-({[(1S,2R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил]метил}сульфинил)этановая кислота формулы I:

обладающая антиагрегационным действием.