Бромиды 1-замещенных-3-{ [2-(3,5-ди-трет-4-гидроксифенил)-2-оксоэтил]} -2-аминобензимидазолия, обладающие антиагрегантными и антиоксидантными свойствами Российский патент 2017 года по МПК C07D235/14 A61K31/4184 A61P7/02 

Изобретение относится к новым производным в ряду галогенидов 1,3-дизамещенных-2-аминобензимидазолия, а именно к новым бромидам 1-замещенных-3-{[2-(3,5-ди-трет-4-гидроксифенил)-2-оксоэтил]}-2-аминобензимидазолия общей формулы I:

,

где (Ia) R = н-пропил, (Iб) R = аллил,

обладающим антиагрегантными и антиоксидантными свойствами, которые могут быть использованы для лечения инфаркта миокарда и инсульта, вызванных тромбообразованием в сосудах.

Повышенный риск тромбообразования приводит к жизнеугрожающим состояниям, таким как инсульт и инфаркт миокарда [1].

Ключевую роль в возникновении тромбозов играет активация тромбоцитарного звена гемостаза, которая включает адгезию, активацию и агрегацию тромбоцитов [2].

Адгезия тромбоцитов связана с активацией ряда субэндотелиальных молекул (коллагена, фибронектина, лиминина). Активация тромбоцитов выражается в изменении их формы, усилении прокоагулянтной активности, внеклеточной секреции тромбоцитарных гранул. Тромбоцитарные агонисты (аденозиндифосфат (АДФ) и серотонин), адгезивные гликопротеины (фибриноген и фактор фон Виллебранда) и тромбоцитарный активатор (тромбоксан А2) стимулируют агрегацию тромбоцитов, результатом которой является образование тромбоцитарного тромба.

Также не последнюю роль в патогенезе образования тромбов играет активация перекисного окисления липидов [3].

Оксиданты влияют на тромбоциты через потенцирование эффекта фактора активации тромбоцитов. Супероксид и гидроксильные радикалы в течение нескольких секунд необратимо ингибируют ФАТ-ацетилгидролазу - фермент, разрушающий ФАТ, тем самым пролонгируя его агрегационное действие. Кроме того, оксиданты нарушают процессы синтеза эндотелием тромбомодулина, ингибитора тканевого фактора, простациклина, тканевого активатора плазминогена - веществ, которые способны предотвращать образования сосудистых тромбов. Также в присутствии супероксидных радикалов уменьшается период жизни окиси азота, что может вызывать эндотелиальную дисфункцию. Кроме того, оксидативный стресс приводит к атерогенной модификации липопротеинов низкой плотности и появлению на поверхности сосудов липидных отложений, изъязвлению и разрыву атеросклеротических бляшек.

Доступные в настоящее время антитромбоцитарные препараты оказывают влияние на некоторые этапы в процессе агрегации тромбоцитов и активации свертывающей системы крови и тем самым заметно влияют на риск развития артериального тромбоза [4].

Однако они бывают не всегда эффективны и наличие у них побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта ограничивают их применение у некоторых категорий больных. Поэтому новое понимание клеточных уровней патогенеза артериальных тромбозов ведет к разработке новых эффективных антитромбогенных средств, снижающих тромбогенный потенциал крови более эффективно и безопасно, чем это выполняют известные антиагрегантные средства.

В настоящее время выделяют всего три группы антитромбоцитарных препаратов, в основе разделения которых лежат принципы доказательной медицины, учитывающие эффективность и наличие побочных действий [5]. Первая группа, составляющая основу современной антитромбоцитарной терапии, - ингибиторы циклооксигеназы (ЦОГ): ацетилсалициловая кислота, которая признана стандартом антитромботической терапии [6, 7], вторая группа - тиенопиридины (клопидогрель, тиклопидин, плавикс) - селективно блокируют АДФ-рецепторы P2Y₁₂ в тромбоцитах [8], блокаторы ГП-рецепторов Ib/IIIа для внутривенного применения (абциксимаб, эптифибатид, тирофибан, фрамон) [9]. Однако и у этих препаратов существует много недостатков и побочных эффектов.

В ряду галогенидов 1,3-дизамещенных-2-аминобензимидазолия известны галогениды 1-замещенных 3-галогенфенацил-2-аминобензимидазолия, проявляющие гемореологические свойства [10].

Наиболее близкими по выполнению являются галогениды 1-диалкиламиноэтил-3-[замещенный (дизамещенный) фенацил]-2-аминобензимидазолия, проявляющие кардиопротекторные свойства [11] и ингибирующие Na⁺/H⁺ обмен [12].

В ряду галогенидов 1,3-дизамещенных-2-аминобензимидазолия не известны соединения, проявляющие антиагрегантные и антиоксидантные свойства.

Техническим результатом изобретения являются новые соединения в ряду галогенидов 1,3-дизамещенных-2-аминобензимидазолия, содержащие экранированный фенол и проявляющие неизвестные для данного класса соединений антиагрегантные и антиоксидантные свойства с высокой активностью.

Технический результат достигается соединениями формулы I, синтез которых заключается в реакции кватернизации 1-замещенных 2-аминобензимидазолов 2-бром-3',5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксиацетофеноном по следующей схеме:

где (Ia) R = н-пропил, (Iб) R = аллил.

Строение синтезированных соединений доказано элементным анализом, ИК- и ЯМР ¹Н спектрами. В ИК-спектрах солей Iа, б имеются полосы поглощения карбонильной группы в области 1700-1715 см^-1, а также две полосы валентных колебаний первичной аминогруппы в области 3200-3300 см^-1 и гидроксигруппы в области 3600 см^-1, что указывает на существование этих соединений в кристаллическом состоянии в виде солей 2-аминобензимидазолия. В спектрах ЯМР ¹Н этих солей наблюдаются двухпротонные синглетные сигналы (δ 5,94-5,96), которые соответствуют поглощению метиленовых протонов 3',5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксибензоилметильных радикалов. Сигналы протонов аминогруппы (2Н) проявляются в виде узких синглетов с δ 8,76-8,80.

Ниже приведены примеры получения предлагаемых соединений.

Пример 1. Бромид 1-пропил-3-{[2-(3,5-ди-трет-4-гидроксифенил)-2-оксоэтил]}-2-аминобензимидазолия (Iа).

В горячий раствор 0,35 г (2 ммоль) 1-пропил-2-аминобензимидазола в 25 мл ацетона вносят 0,65 г (2 ммоль) 2-бром-3',5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксиацетофенона. Смесь перемешивают до растворения последнего, нагревают до начала выпадения осадка и оставляют стоять в течение 4-6 ч при комнатной температуре. Затем выпавший осадок отфильтровывают, тщательно промывают ацетоном. Выход 0,93 г (92,5%), т.пл. 226-228°С. ИК спектр, ν_max, см^-1: 3550 (ОН), 3207, 3240 (NH₂), 1710 (С=O). Найдено, %: С 62,09; Н 7,19; Br 15,93; N 8,36. C₂₆H₃₆BrN₃O₂. Вычислено, %: С 62,12; Н 7,18; Br 15,95; N 8,38. ¹H - ЯМР-спектр (600 МГц), δ, м.д. (DMSO-d₆): 0,94 (т, 3Н, СН₃); 1,42 (с, 18Н, 2хС(СН₃)з); 1,75 (к, 2Н, СН₂); 4,2 (т, 2Н, СН₂); 5,94 (с, 2Н, СН₂); 7,26-7,35 (м, 2Н, H_Ar); 7,58-7,66 (дд, 2Н, H_Ar); 2,11 (с, 2Н, H_Ar); 8,06 (уш. с, 1Н, ОН); 8,76 (уш. с, 2Н, NH₂).

Пример 2. Бромид 1-аллил-3-{[2-(3,5-ди-трет-4-гидроксифенил)-2-оксоэтил]}-2-аминобензимидазолия (Iб).

Соединение получено аналогично примеру 1. Выход 93%. Т пл. 230-231°С. Найдено, %: С 62,35; Н 6,81; Br 15,99; N 8,38. C₂₆H₃₄BrN₃O₂. Вычислено, %: С 62,38; Н 6,80; Br 16,01; N 8,41. ИК спектр, ν_max, см^-1: 3580 (ОН), 3210, 3240 (NH₂), 1710 (С=O). ¹Н - ЯМР-спектр (600 МГц), δ, м.д. (DMSO-d₆): 1,44 (с, 18Н, 2хС(СН₃)₃); 4,9 (д, 2Н, СН₂), 5,13 (дд, 2Н, СН₂), 5,96 (м, 3Н, СН₂+СН); 7.29-7,84 (м, 6Н, H_Ar); 8,06 (уш. с, 1Н, ОН); 8,81 (c, 2H, NH₂).

Испытания антиагрегантной и антиоксидантной активности бромидов 1-замещенных-3-{[2-(3,5-ди-трет-4-гидроксифенил)-2-оксоэтил]}-2-аминобензимидазолия Iа, б.

Антиагрегантная и антиоксидантная активности изучены на кафедре фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета.

В исследованиях in vitro влияние веществ на агрегацию тромбоцитов изучали по методу Born G. [13] в модификации Габбасова З.А. и др. [14] на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов НПФ «Биола» (Россия). Метод основан на регистрации степени изменений светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами, при добавлении к последней веществ, индуцирующих агрегацию, в условиях постоянного перемешивания, а также на анализе флюктуаций светопропускания, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале. Обязательным условием возникновения агрегации является механическое перемешивание плазмы, которое проводится с помощью магнитной мешалки, прилагаемой к агрегометру.

Для получения богатой тромбоцитами плазмы цитратную кровь центрифугировали при 1500 оборотах в течение 10 минут на центрифуге Multicentrifuge CM 6М (Латвия). Количество тромбоцитов в пробе было постоянным. Прибор предварительно калибровался по двум точкам: светопропускание бедной тромбоцитами плазмы принималось за 0%, а светопропускание богатой тромбоцитами плазмы - за 100%, а средний размер одиночного тромбоцита - за единицу. В кювету агрегометра вносилось 300 мкл богатой тромбоцитами плазмы, добавлялся раствор соединения в объеме 10 мкл, смесь инкубировалась в течение 5 мин при температуре 37°С. На 10 секунде регистрации записи агрегатограммы в кювету добавлялся индуктор агрегации - АДФ («Sigma», США) в конечной концентрации 5 мкМ. При графической регистрации процесса агрегации тромбоцитов [15] получали кривые, отражающие падение оптической плотности обогащенной тромбоцитами плазмы. Уровень агрегации оценивался по величине максимальной амплитуды агрегатограммы по сравнению с исходной величиной оптической плотности. В качестве показателей агрегации использовали степень агрегации и скорость агрегации. Степень агрегации определялась как максимальное приращение светопропускания после добавления индуктора в кювету агрегометра. Скорость агрегации оценивалась по величине максимального наклона кривой агрегатограммы.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Антиоксидантную активность веществ изучали по методу in vitro на модели аскорбат-зависимого ПОЛ [16].

Соединения исследовали в диапазоне концентраций 1×10^-6-1×10^-3 М. В качестве субстрата использовали 4% гомогенат печени крыс. Реакцию инициировали 50 мМ аскорбиновой кислоты (Chemapol, Чехия). О скорости окисления судили по накоплению малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Fluka, Швейцария). Оптическую плотность окрашенного продукта измеряли при длине волны 532 нм на спектрофотометре PD-303 UV (APEL, Япония) в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность веществ оценивали в % по отношению к пробе без соединения. В качестве препарата сравнения использовали мексидол (ООО «Фармасофт», Россия) и тролокс (Fluka, Швейцария). Расчет IC₅₀ (ингибирующая концентрация, подавляющая ПОЛ на 50%) выполнялся с применением регрессионного анализа в программе Microsoft Excell.

Результаты исследований приведены в таблице 2.

В ходе проведенного исследования установлено, что производные бензимидазола, имеющие в своей структуре экранированный фенол, в различной степени выраженности оказывают антиагрегантный эффект in vitro. Судя по приведенным в таблице 1 данным, соединения под шифрами Iа и Iб дозозависимо блокировали функциональную активность тромбоцитов и по IC₅₀ превосходили ацетилсалициловую кислоту в 17,6 и 19,6 раз соответственно (табл. 1). При изучении антиоксидантной активности данных соединений наблюдалось достоверное дозозависимое ингибирование аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов. Так, соединение Iа по IC₅₀ антиоксидантной активности превосходит препараты сравнения мексидол и тролокс в 16,8 и 47,3 раза соответственно. Вещество Iб по данному показателю проявляет активность в 22,5 раза выше, чем мексидол и в 43,4 раза превосходит тролокс (табл. 2).

В результате проведенных исследований установлено, что соединение Iа и Iб проявляют новую для ряда галогенидов 1,3-дизамещенных-2-аминобензимидазолия выраженную антиагрегантную и антиоксидантную активности в тесте in vitro, что имеет важное значение для разработки новых антитромбогенных средств, применяющихся в терапии тромботических состояний.

Список литературы

1. Кадыков А.С. Антиагрегантная терапия в первичной и вторичной профилактике ишемического инсульта / А.С. Кадыков, Н.В. Шахпаронова, А.В. Кадыков // Cardioсоматика. - 2013. - №3. - С. 38-41.

2. Голухова Е.З. Современные аспекты антиагрегантной терапии / Голухова Е.З., Рябинина М.Н. // Креативная кардиология. - 2013. - №1. - С. 45-58.

3. Freedman, J.E. Oxidative stress and platelets / J.E. Freedman // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2008. - P. 11-6.

4. Mazepa, M. Superactivated platelets: thrombus regulators, thrombin generators, and potential clinical targets. / M. Mazepa, M. Hoffman, D. Monroe // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2013. - 33(8).

5. Шалаев С.В. Антитромбоцитарные средства в предуперждении осложнений атеросклеротических заболеваний: «движение за аспирин» / С.В. Шалаев // Кардиология. - 2006. - №6. - С. 84-87.

6. Рекомендации Российского Кардиологического сообщества для лечения острых коронарных синдромов без подъема сегмента ST. – 2006.

7. Панченко, П. Концепция атеротромбоза - основа патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний. Основные направления антитромботической терапии / П. Панченко // Русский медицинский журнал, - 2005. - Т. 13. - №7. С. 433-440.

8. Kim, S. P2Y₁₂ receptor in platelet activation. / S. Kim, S.P. Kunapuli // Platelets. - 2011; 22(1): P. - 56-60.

9. Cattaneo, M. P2Y12 receptors: structure and function. / M. Cattaneo // J. Thromb Haemost. 2015 Jun; 13 Suppl 1: S.-10-6.

10. Анисимова В.А., Толпыгин И.Е., Минкин В.И., Спасов А.А., Степанов А.В., Арькова Н.В., Науменко Л.В., Петров В.И., Патент РФ №2290404, C07D 487/04, 2006.

11. Спасов А.А., Анисимова В.А., Гурова Н.А., Тимофеева А.С., Федорчук В.Ю., Минкин В.И., патент РФ №2526902, A61K 31/5377, 2014.

12. Анисимова В.А., Спасов А.А., Гурова Н.А., Толпыгин И.Е, Федорчук В.Ю., Петров В.И., Минкин В.И., Патент РФ №2518741, A61K 31/416, 2014.

13. Born G.V. The aggregation of platelet / G.V. Born, V.J. Cross // J. Physiol. - 1963. - V. 16. - P. 178-195.

14. Габбасов З.А. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов / З.А. Габбасов, Е.Г. Попов, И.Ю. Гаврилов и др // Лабораторное дело. - 1989. - N.10. - C. 15-18.

15. Люсов В.А. Метод графической регистрации агрегации тромбоцитов и изменения ее при ишемической болезни сердца / В.А. Люсов, Ю.Б. Белоусов // Кардиология. - 1971. - №8. - С. 459-461.

16. Ланкин В.З. Переокисление липидов в печени животных с экспериментальным атеросклерозом, в кн: «Физико-химические основы функционирования надмолекулярных структур клетки» / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Н.В. Котелевцева, Е.Н. Герасимова // изд-во МГУ. М. 1974. ч 1. С. 15-18.

Изобретение относится к новым производным бензимидазола общей формулы I, где (Ia) R = н-пропил, (Iб) R = аллил, обладающим антиагрегантными и антиоксидантными свойствами. Технический результат - получены новые производные бензимидазола, полезные при лечении инфаркта миокарда и инсульта. 2 табл., 2 пр.

Бромиды 1-замещенных-3-{[2-(3,5-ди-трет-4-гидроксифенил)-2-оксоэтил]}-2-аминобензимидазолия общей формулы I

где R=н-пропил, аллил.